Die Abschirmung von Aktin durch das endoplasmatische Retikulum beeinflusst die Kernpositionierung

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2763 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Kernposition ist für die Zellpolarisierung von zentraler Bedeutung und ihre Störung ist mit verschiedenen Pathologien verbunden. Der Zellkern wird durch seine Verbindung mit sich bewegenden dorsalen Aktinkabeln und das Fehlen von Verbindungen zu unbeweglichen ventralen Stressfasern von der Vorderkante wandernder Zellen wegbewegt. Es ist unklar, wie diese asymmetrischen Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen hergestellt werden. Mithilfe eines In-vitro-Wundtests stellen wir fest, dass die Umgestaltung des endoplasmatischen Retikulums (ER) die Kernpositionierung durch die Bildung einer Barriere beeinflusst, die unbewegliche ventrale Stressfasern abschirmt. Der Umbau des ER und die perinukleare ER-Akkumulation wird durch das ER-formende Protein Climp-63 vermittelt. Darüber hinaus stellt die ektopische Rekrutierung des ER zur Belastung von Fasern die Kernpositionierung in Abwesenheit von Climp-63 wieder her. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das ER asymmetrische Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen vermittelt, um den Kern zu positionieren.

Der Zellkern wird in Lehrbüchern oft als schwebend im Zentrum der Zelle dargestellt. Die Position des Zellkerns ist jedoch stark reguliert und mit der Zellfunktion verbunden1. Die Position des Zellkerns ändert sich häufig während verschiedener biologischer Prozesse wie Zellteilung, Zelldifferenzierung und Zellmigration2,3,4. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Kernpositionierung mit speziellen Zellfunktionen zusammenhängt und dass eine Fehlregulierung der Kernpositionierung zu Zellfunktionsstörungen und Krankheiten wie zentronukleären Myopathien, Progerie und Lissenzephalie führen könnte5,6.

Die Kernpositionierung erfordert häufig Verbindungen des Kerns mit dem Zytoskelett7. Diese Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen werden hauptsächlich durch den LInker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC)-Komplex an der Kernhülle8 vermittelt. Der LINC-Komplex besteht aus Proteinen der äußeren Kernhülle (ONM) der Nesprin-Familie, die mit dem Zytoskelett interagieren, und Proteinen der inneren Kernhülle (INM) der SUN-Familie, die mit der Kernschicht interagieren. Die KASH-Domänen der Nesprin-Proteine ​​interagieren mit den SUN-Domänen der SUN-Proteine ​​im Lumen der Kernhülle9. Es wurde festgestellt, dass mehrere Proteine ​​durch den LINC-Komplex an Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen beteiligt sind. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen während der Kernpositionierung ein- und ausgeschaltet werden10,11.

Die Position des Zellkerns während der Zellmigration ist von größter Bedeutung, da sie die Geschwindigkeit der Migration10,12, die Wahl des Weges mit dem geringsten Widerstand13 und das Durchbrechen endothelialer Barrieren14 beeinflussen kann. Der Wundheilungstest ist ein klassischer Ansatz zur Untersuchung der Zellmigration, bei dem Zellen am Wundrand mit dem Serumfaktor Lysophosphatidsäure (LPA) stimuliert werden, um ihren Zellkern von der Vorderkante wegzubewegen12,15. Die Rückwärtsbewegung des Kerns wird durch die Bewegung dorsaler Aktinkabel angetrieben, die über lineare Anordnungen des Kernhüllenproteins Nesprin-2G mit dem Kern verbunden sind und als transmembrane Aktin-assoziierte (TAN) Kernlinien bezeichnet werden12,15. Während der Kernbewegung verbindet sich der Kern nicht mit den unbeweglichen ventralen Spannungsfasern, obwohl Nesprin-2G symmetrisch in der gesamten Kernhülle verteilt ist12. Daher ist der Kern während der Kernbewegung asymmetrisch mit dorsalen Aktinkabeln verbunden, nicht jedoch mit ventralen Stressfasern. Es ist nicht bekannt, wie diese asymmetrischen Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen hergestellt werden.

Das endoplasmatische Retikulum (ER) grenzt an die Kernhülle und ist der zentrale Knoten im Organellen-Interaktom-Netzwerk16. Das ER breitet sich im gesamten Zytoplasma als ein miteinander verbundenes komplexes Netzwerk aus flachen Strukturen (Blättern), retikulären Netzwerken (Tubuli) und einem dichten Netzwerk von Tubuli (ER-Matrizen) aus. Die Morphologie und Verteilung des ER-Komplexes wird durch ER-formende Proteine ​​reguliert17,18,19. Daher wollten wir untersuchen, ob die ER-Morphologie und -Verteilung die Kernpositionierung regulieren kann. Hier zeigen wir, dass das ER an der Herstellung asymmetrischer Nukleozytoskelett-Verbindungen beteiligt ist, die für die Kernpositionierung erforderlich sind.

Es ist nicht bekannt, wie die Notaufnahme während der nuklearen Positionierung organisiert ist. Daher untersuchten wir die ER-Morphologie und -Verteilung während der Kernpositionierung bei migrierenden NIH3T3-Fibroblasten. Wir haben den Wundheilungstest verwendet, bei dem LPA die Positionierung des Kerns nach hinten in Zellen am Wundrand induziert. Um zu verstehen, wie sich das ER während der Kernpositionierung organisiert, haben wir das ER in Nicht-LPA-Zellen (nicht polarisiert) und LPA-stimulierten Zellen (polarisiert) am Wundrand mithilfe der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) analysiert (Abb . 1a–d). Das ER kann Schichten, Tubuli oder Matrizen bilden, die durch ER-formende Proteine ​​vermittelt werden17,18,19. Die Analyse des FIB-SEM-Zellvolumens ergab einen erheblichen Unterschied in der ER-Morphologie und -Verteilung zwischen Nicht-LPA- und LPA-stimulierten Zellen. Die LPA-stimulierte Zelle zeigte im Vergleich zur nicht LPA-stimulierten Zelle eine Zunahme der ER-Blätter (dunkelrot) auf Kosten einer Verringerung der ER-Tubuli (hellrot) (Abb. 1a–d). Darüber hinaus zeigte die LPA-stimulierte Zelle im Vergleich zur nicht LPA-stimulierten Zelle eine Akkumulation von perinukleärem ER (Abb. 1b, d; ergänzende Abb. 1a, b). Die für FIB-SEM verwendeten Aufnahmebedingungen wurden so ausgewählt, dass sie einen Schritt von 8 nm in der Z-Position ergeben, was es uns ermöglichte, die bemerkenswert komplexen und verschlungenen ER-Strukturen dreidimensional (3D) zu segmentieren und darzustellen. Die Analyse der ER-Morphologie in 3D bestätigte, dass perinukleäres ER in der LPA-stimulierten Zelle größtenteils in Schichten organisiert ist, wohingegen nicht-LPA-stimulierte Zellen mehr ER-Tubuli aufwiesen (ergänzende Abbildung 1a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich ER während der Kernpositionierung im perinukleären Bereich ansammelt und einen Übergang von Tubuli zu Blättern durchläuft.

ein repräsentatives FIB-SEM-Bild einer nicht LPA-stimulierten, nicht polarisierten U2OS-Zelle am Wundrand. Ein Stapel von 998 REM-Bildern von einer Vorderkantenzelle. b Repräsentative Bilder perinukleärer (gelbe Einschübe) und peripherer (grüne Einschübe) Regionen. Das ER ist rot hervorgehoben, hellrot steht für Tubuli (<1 µm), dunkelrot steht für Blätter (>1 µm). Die Maße geben die Tiefe des Abschnitts an. c wie in a, aber eine LPA-stimulierte und polarisierte Zelle. Ein Stapel von 1798 REM-Bildern von einer Vorderkantenzelle. d wie in b, jedoch eine LPA-stimulierte und polarisierte Zelle. e Repräsentative Weitfeld-Epifluoreszenzbilder von NIH3T3-Fibroblasten am Wundrand. Die Zellen wurden auf Zell-Zell-Kontakte (lila; β-Catenin), Zentrosom (weiß; Pericentrin) und DNA (DAPI, blau) immungefärbt. f Kernpositionen relativ zum Zellschwerpunkt der in e dargestellten Zellen. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen den experimentellen Bedingungen und der Scramble-siRNA mit LPA berechnet. ****p < 0,0001 (Scramble no LPA, Nesprin-2G, Climp-63 #1, Climp-63 #2, Triple KD); *p < 0,05. Das Feld zeigt das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil, und die Whiskers zeigen das 10–90 %-Perzentil. Die Experimente wurden ≥3 wiederholt, mit Ausnahme von (a–d). Maßstabsbalken: a, b, c, d 1 µm; e 40 µm.

Um zu testen, ob die ER-Morphologie an der rückwärtigen Kernpositionierung beteiligt ist, haben wir mehrere Proteine ​​manipuliert, die das Verhältnis von ER-Faltblättern zu Tubuli und die ER-Verteilung modulieren, sogenannte ER-formende Proteine20. Wir haben ER-Faltblatt-verwandte Proteine ​​(Climp-63, p180, Kinectin-1, Myosin-1C) und ein Protein, das an der Aufrechterhaltung der ER-Tubuli beteiligt ist (Reticulon-4), abgereichert (Abb. 1e, f; ergänzende Abb. 1c, d). 17,18,19,21,22,23,24. Die Abreicherung von Climp-63 (Zytoskelett-verknüpfendes Membranprotein 63) blockierte die rückwärtige Kernpositionierung in Wundrandfibroblasten bei LPA-Stimulation im gleichen Maße wie in Nesprin-2G-abgereicherten Zellen (Abb. 1f). Die Abreicherung anderer Proteine, die an der ER-Faltblattmorphologie beteiligt sind (p180, Kinectin-1 und Myosin-1C), blockierte ebenfalls die Kernpositionierung, allerdings nur um 40 % im Vergleich zu Nesprin-2G-abgereicherten Zellen. Die Erschöpfung von Reticulon-4 (im Zusammenhang mit der Bildung von ER-Tubuli) hatte keinen Einfluss auf die Positionierung des Kerns nach hinten. Um weiter zu untersuchen, wie Änderungen in der ER-Morphologie und -Verteilung die Kernbewegung blockierten, führten wir eine Zeitraffermikroskopie während der LPA-stimulierten Kernbewegung in Scramble- und Climp-63-siRNA-Zellen durch (ergänzende Abbildung 1e). Die Quantifizierung der Persistenz und der Richtungspersistenz der Kernbewegung ergab, dass die Climp-63-Depletion die Rückwärtsbewegung des Kerns im Vergleich zu Scramble-siRNA-Spitzenzellen beeinträchtigte (ergänzende Abbildung 1f – h). Daher ist das ER-formende Protein Climp-63 für die Kernpositionierung erforderlich.

Um zu untersuchen, ob Climp-63 eine Rolle bei der perinukleären ER-Akkumulation während der Kernpositionierung spielt, haben wir das ER in nicht-LPA- und LPA-stimulierten Fibroblasten am Wundrand analysiert. In nicht LPA-stimulierten Zellen beeinträchtigte die Climp-63-Depletion die perinukleäre ER-Akkumulation nicht (Abb. 2a, b). Bei der LPA-Stimulation beobachteten wir jedoch einen Anstieg der perinukleären ER-Akkumulation, der von Climp-63 abhängig war (Abb. 2a, b).

a Repräsentative konfokale Airyscan-Punktscanning-Bilder von GFP-KDEL-exprimierenden Fibroblasten am Wundrand, behandelt mit Scramble- oder Climp-63-siRNA, stimuliert und nicht stimuliert mit LPA. Perinukleäre Regionen von Interesse (ROI) werden hervorgehoben (gelbes Feld) und als Grauskala (oben) und als Heatmap (unten) dargestellt. b Quantifizierung der perinukleären ER-Akkumulation der in a dargestellten Zellen. behandelt mit Scramble (grau) oder Climp-63 (grün) siRNA. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen experimentellen Bedingungen und Scramble mit LPA (zweite Bedingung) berechnet. c Konfokales Fluoreszenz-Spinning-Disk-Kymogramm der Kernbewegung und perinukleären ER-Akkumulation in GFP-KDEL-exprimierenden Zellen am Wundrand, behandelt mit Scramble- (oben) oder Climp-63-siRNA (unten) nach LPA-Stimulation. Die Bilder entsprechen der maximalen Intensitätsprojektion von Z-Stapeln von der ventralen zur dorsalen Seite der Zelle. Die Signalintensität wird als thermische Heatmap dargestellt. d Quantifizierung der perinukleären ER-Akkumulation in LPA-stimulierten Zellen, die mit Scramble- (grau, n = 22 Zellen aus 4 unabhängigen Experimenten) oder Climp-63-siRNA (grün, n = 21 Zellen aus 4 unabhängigen Experimenten) behandelt wurden, über die Zeit, dargestellt in c. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde für jeden Zeitpunkt zwischen Scramble- und Climp-63-siRNAs berechnet. e Quantifizierung der perinukleären ER-Akkumulation (graue Linie) und der Kernbewegung über die Zeit (blaue Linie) in LPA-stimulierten Zellen im Scramble (links, n = 61 Zellen aus 4 unabhängigen Experimenten) oder Climp-63 (rechts, n = 37 Zellen). von 4 unabhängigen Experimenten) siRNA. Bei der perinukleären ER-Akkumulation handelt es sich um die gleichen Daten wie in d. Maßstabsbalken: a, c 10 µm. Fehlerbalken, REM. **p < 0,01, *p < 0,05.

Als nächstes wurde eine Zeitraffermikroskopie von Wundrand-Scramble-siRNA-Zellen verwendet, die stabil mit GFP-KDEL, das das ER markiert, transfiziert waren, um den Zusammenhang zwischen Kernpositionierung und perinukleärer ER-Verdichtung bei LPA-Stimulation zu untersuchen. In Scramble-siRNA-Zellen führte die LPA-Stimulation zu ER-Akkumulation in der perinukleären Region, die mit der Rückwärtsbewegung des Kerns korrelierte (Abb. 2c – e (links); Zusatzfilm 1). In Abwesenheit von Climp-63 beobachteten wir eine geringfügige Akkumulation von perinukleärem ER bei LPA-Stimulation, während keine Belohnungskernbewegung beobachtet wurde (Abb. 2c – e (rechts), Zusatzfilm 2). Scramble-siRNA-Zellen erhöhten das perinukleäre ER um 25 %, 120 Minuten nach LPA-Stimulation im Vergleich zu 5 Minuten. Andererseits stiegen die Climp-63-siRNA-Knockdown-Zellen (KD) nur um 9 % (120 Min. vs. 5 Min.) (Abb. 2d). In Abwesenheit von LPA zeigten mit Scramble- oder Climp-63-siRNA behandelte Zellen im Laufe der Zeit weder eine perinukleäre ER-Verdichtung noch eine Kernbewegung (ergänzende Abbildung 2a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die perinukleäre ER-Akkumulation während der Kernpositionierung in Climp-63-abhängiger Weise erfolgt.

Climp-63 ist ein integrales ER-Single-Spanning-Transmembranprotein mit einer luminalen und einer zytoplasmatischen Domäne (Abb. 3a). Die Homodimerisierung seiner Lumendomäne ist an der Regulierung der ER-Luminalbreite beteiligt und macht Climp-63 zu einem ER-Luminalspacer 19,21. Andererseits bindet seine zytoplasmatische Domäne auf phosphorylierungsabhängige Weise an Mikrotubuli, was zur ER-Faltblattverteilung beiträgt19,21,27. Climp-63 ist hauptsächlich mit der Aufrechterhaltung perinukleärer ER-Faltblätter verbunden21. Um die Domänen von Climp-63 zu identifizieren, die an der Kernpositionierung und der perinukleären ER-Akkumulation beteiligt sind, haben wir eine Reihe von Climp-63-Fragmenten in Climp-63-abgereicherte Fibroblasten am Wundrand mikroinjiziert (Abb. 3a). Die Expression der luminalen Domäne, jedoch nicht der zytoplasmatischen Domäne, in Climp-63-depletierten Zellen reichte aus, um die Kernpositionierung und die perinukleäre ER-Akkumulation wiederherzustellen (Abb. 3b – d). Die Expression von Climp-63-Konstrukten voller Länge mit Mutationen in der Mikrotubuli-Bindungsdomäne, die die Interaktion mit Mikrotubuli verhindern oder verstärken, reichte aus, um nicht nur die Kernpositionierung, sondern auch die perinukleäre ER-Akkumulation wiederherzustellen (Abb. 3b–d)26,28. Darüber hinaus hat die Depletion von Climp-63 keinen Einfluss auf das Mikrotubuli-Netzwerk in Wundrandzellen (ergänzende Abbildung 2c). Diese Ergebnisse zeigen, dass die luminale Domäne von Climp-63 unabhängig von der Wechselwirkung von Climp-63 mit Mikrotubuli ausreicht, um die Kernpositionierung und die perinukleäre ER-Akkumulation zu retten. Daher nehmen wir an, dass die perinukleäre ER-Akkumulation für die Kernpositionierung erforderlich ist und dass auch Veränderungen in der ER-Morphologie an diesem Prozess beteiligt sein könnten.

a Schematische Darstellung der mit Climp-63 synthetisierten Plasmide. Climp-63 ist das Volllängenprotein. Dem zytoplasmatischen (Cyto) Mutanten fehlt die luminale Domäne. Der luminalen Mutante (Lum) fehlt die zytoplasmatische Domäne. Die (−) MT-Mutante bindet nicht an Mikrotubuli. Die (+) MT-Mutante ist konstitutiv an Mikrotubuli gebunden. Die Sternchen stellen die siRNA-resistenten Mutationen dar. b Durchschnittliche Kernpositionen relativ zum Zellschwerpunkt von Zellen, die mit Scramble- oder Climp-63-siRNA behandelt und mit den angegebenen Plasmiden mikroinjiziert wurden. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen den Versuchsbedingungen und Climp-63-siRNA-Zellen (zweite Bedingung) berechnet. ****p < 0,0001 (Scramble allein, Climp-63); Die Box zeigt das erste Quartil, den Median und das dritte Quartil, und die Whiskers zeigen das 10–90 %-Perzentil. c Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen mit perinukleärer ER-Akkumulation. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen experimentellen Bedingungen und Climp-63-exprimierenden Zellen (dritte Bedingung) berechnet. Fehlerbalken, REM. d Repräsentative konfokale Punktscan-Bilder von Wundrandzellen, die mit Climp-63-siRNA behandelt und mit den in a gezeigten Plasmiden mikroinjiziert wurden. Perinukleäre ROI werden hervorgehoben (gelbes Feld) und als Grauskala (oben) und als Heatmap (unten) dargestellt. Die Experimente wurden ≥3 wiederholt. Maßstabsbalken: d 10 µm. **p < 0,01, *p < 0,05.

Die Kernpositionierung in Wundrandfibroblasten wird durch den retrograden Aktinfluss gesteuert, der dorsale Aktinkabel von der Vorderkante wegbewegt. Wenn diese Rückenkabel die Rückseite des Kerns erreichen, verankern sie sich an Nesprin-2G an der Kernhülle und lösen die Bildung linearer Anordnungen von Nesprin-2G aus, die als TAN-Linien bekannt sind12,29,30,31. Somit treibt die Bewegung dorsaler Aktinkabel, die an TAN-Linien verankert sind, die Kernbewegung an. Wir haben die Rolle von Climp-63 auf den retrograden Aktinfluss, die TAN-Linien und die Aktinorganisation analysiert. Um den retrograden Aktinfluss zu messen, verwendeten wir stabil transfizierte Zellen, die LifeAct-mCherry exprimierten, und stellten fest, dass die Climp-63-Depletion die Richtung und Geschwindigkeit des retrograden Aktinflusses im Vergleich zu Scramble-siRNA-Zellen nicht beeinträchtigte (ergänzende Abbildung 3a – c). Die Expression der Climp-63-Luminaldomäne in Climp-63-siRNA-Zellen (die die perinukleäre ER-Akkumulation und Kernpositionierung rettet) hatte im Vergleich zu Scramble-siRNA-Zellen ebenfalls keinen Einfluss auf die retrograde Aktinflussgeschwindigkeit (ergänzende Abbildung 3c). Um den Aufbau der TAN-Linien zu untersuchen, injizierten wir Scramble- und Climp-63-siRNA-behandelte Wundrandzellen mit EGFP-mini-N2G, einer Sonde, die sich an TAN-Linien12 ansammelt, mikroinjizierten und stellten fest, dass die Climp-63-Depletion keinen Einfluss auf die Anzahl der TAN-Linien pro Zellkern hat noch der Prozentsatz der Kerne mit TAN-Linien (Abb. 4a – c). Darüber hinaus ergab die Analyse der Organisation des Aktin-Zytoskeletts, dass Climp-63 KD keinen Einfluss auf die Aktin-Netzwerkarchitektur in der perinukleären Region hatte. Wir haben keine Veränderungen in der Morphologie und Anzahl der ventralen Stressfasern oder dorsalen Aktinkabel pro Kern zwischen Scramble- und Climp-63-siRNA-behandelten Zellen beobachtet (Abb. 4d – f). Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Climp-63- und perinukleäre ER-Akkumulation nicht an der Beteiligung des retrograden Aktinflusses und an der Verbindung von dorsalem Aktin mit den TAN-Linien der Kernhülle auf der Rückseite des Kerns beteiligt sind.

a Repräsentative Epifluoreszenzbilder von Scramble- oder Climp-63-siRNA-behandelten Fibroblasten, die GFP-mini-N2G exprimieren und mit Phalloidin (F-Actin) gefärbt sind. Die Pfeile zeigen die Kolokalisierung von Nesprin-2G mit dorsalen Aktinkabeln. b Quantifizierung der Anzahl der TAN-Linien pro Kern in Zellen, die wie in a mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden. c Quantifizierung des Prozentsatzes von Kernen mit TAN-Linien in Zellen, die wie in a mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden. d Repräsentative Epifluoreszenzbilder von Wundrandzellen nach LPA-Stimulation. Die Zellen wurden wie folgt gefärbt: F-Actin (Phalloidin, rot), DNA (DAPI, blau). Kernregion, hervorgehoben durch ein gelbes gestricheltes Kästchen. Links: Ventrale Brennebene. Rechts: Dorsale Brennebene. e Quantifizierung der Anzahl nukleärer ventraler Stressfasern pro Kern in Zellen, die mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden, wie in d. f Quantifizierung der Anzahl nukleärer dorsaler Aktinkabel pro Kern in Zellen, die mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden, wie in d. g Fluoreszenzkymograph der Kernbewegung und der ventralen ER-Akkumulation in GFP-KDEL-exprimierenden Zellen am Wundrand, die nach LPA-Stimulation mit Scramble- (oben) oder Climp-63-siRNA (unten) behandelt wurden. h Quantifizierung der ventralen ER-Akkumulation während der LPA-Stimulation in mit Scramble (grau) oder Climp-63 (grün) siRNA behandelten Zellen, dargestellt in g. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde für jeden Zeitpunkt zwischen Scramble- und Climp-63-siRNAs berechnet. i Quantifizierung der perinukleären ER-Akkumulation (graue Linie) und der Kernbewegung im Zeitverlauf (blaue Linie) während der LPA-Stimulation von Zellen, dargestellt in g. Die graue Linie entspricht der grauen Linie in h. j Fluoreszenzkymograph der Kernbewegung und der dorsalen ER-Akkumulation in GFP-KDEL-exprimierenden Zellen am Wundrand, behandelt mit Scramble- (oben) oder Climp-63-siRNA (unten) nach LPA-Stimulation. k Quantifizierung der dorsalen ER-Akkumulation während der LPA-Stimulation in mit Scramble (grau) oder Climp-63 (grün) siRNA behandelten Zellen, dargestellt in j. Die Experimente wurden dreimal wiederholt. Maßstabsbalken: a, d 5 µm; g, j 20 µm. Fehlerbalken, REM. **p < 0,01, *p < 0,05.

Als nächstes untersuchten wir die Ansammlung von ER auf der dorsalen und ventralen Seite des Kerns während der Kernbewegung. Wir haben die perinukleäre Akkumulation des ER-Markers KDEL während der Kernpositionierung nach LPA-Stimulation an der dorsalen und ventralen Seite des Kerns in Scramble- und Climp-63-siRNA-behandelten Zellen quantifiziert (Abb. 4g – k). Auf der ventralen Seite des Kerns beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der ER-Akkumulation während der Kernbewegung in Scramble-siRNA-Zellen, wohingegen in Climp-63-siRNA-Zellen kein Anstieg beobachtet wurde (Abb. 4g – h). Darüber hinaus korreliert die Kernbewegung mit der ventralen ER-Akkumulation (Abb. 4i). Im Gegensatz dazu beobachteten wir keinen Unterschied in der dorsalen ER-Akkumulation zwischen Scramble- und Climp-63-siRNA-behandelten Zellen während der Kernbewegung (Abb. 4j, k). Die unterschiedliche Rolle von Climp-63 bei der Akkumulation des ER auf der ventralen und der dorsalen Seite des Zellkerns war nicht auf die Lokalisierung von Climp-63 zurückzuführen, da mikroinjiziertes GFP-Climp-63 in Climp-63-abgereicherten Zellen gleichmäßig in der ventralen und der dorsalen Seite verteilt war Dorsalseite des Kerns (Ergänzende Abb. 4a, b).

Hochauflösende Mikroskopietechniken, Airyscan und Strukturbeleuchtungsmikroskopie (SIM) bestätigten die Reduktion von ER im ventralen Bereich des Zellkerns in Climp-63-KD-Zellen im Vergleich zu Scramble-KO-Zellen weiter (ergänzende Abbildung 4c – e). Darüber hinaus ergab die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sagittaler Schnitte von Wundrandzellen eine Verringerung der ventralen ER-Lumenbreite und -Fläche bei Climp-63-Depletion, wohingegen die Lumenbreite der Kernhülle nicht beeinträchtigt wurde (ergänzende Abbildung 4f – j). Die Verringerung der ER-Lumenbreite bei Climp-63-Depletion ähnelte der zuvor berichteten Reduzierung des nicht-ventralen ER-Lumens in Climp-63-depletierten Zellen19,21. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich das ER während der Kernpositionierung sowohl im ventralen als auch im dorsalen Bereich ansammelt. Die Akkumulation des ER auf der ventralen Seite ist Climp-63-abhängig. Andererseits ist die Akkumulation von ER auf der dorsalen Seite unabhängig von Climp-63 und beeinträchtigt nicht die Verankerung des Kerns an dorsalen Aktinkabeln, die die Kernbewegung antreiben.

Während der Kernpositionierung stellt der Kern asymmetrische Nukleozytoskelett-Verbindungen her, indem er an sich bewegendes dorsales Aktin bindet, nicht jedoch an unbewegliche ventrale Stressfasern12. Während dorsales Aktin am retrograden Aktinfluss beteiligt ist, verbinden sich ventrale Spannungsfasern mit fokalen Adhäsionen und sind daher unbeweglich. Es bleibt unklar, warum ventrale Stressfasern keine Verbindung zum Kern herstellen, obwohl Nesprin-2G und andere Proteine ​​des LINC-Komplexes symmetrisch in der gesamten Kernhülle verteilt sind10,12.

Um zu verstehen, ob die Ansammlung von ventralem ER während der Kernpositionierung mit ventralen Stressfasern zusammenhängt, führten wir während der Kernpositionierung eine Zeitraffer-SIM von Aktin und ER auf der ventralen Seite des Kerns in Wundrandzellen durch. Wir haben beobachtet, dass sich das ventrale ER um die ventralen Spannungsfasern wickelt und diese umschließt (Abb. 5a), was mit unserer vorherigen Beobachtung übereinstimmt, dass sich ER während der Kernpositionierung im perinukleären Bereich ansammelt. Das ventrale ER wies während der Kernbewegung geringfügige Verschiebungen entlang dieser ventralen Spannungsfasern auf, was auf eine enge und dynamische Wechselwirkung zwischen dem ER und den ventralen Spannungsfasern schließen lässt. Die Z-Stacking-Bildgebung ergab zwei Haupttypen von Wechselwirkungen: Das ER wickelte Aktin entlang der Stressfaser oder ähnelte ER-Haken um Fasern (ergänzende Abbildung 5a, ergänzender Film 3–4). In Zellen, denen Climp-63 entzogen war, beobachteten wir eine Verringerung der Anzahl von Zellen mit ventralen Stressfasern, die während der Kernpositionierung von ER umwickelt waren (Abb. 5a, b). Um die Umhüllung von Aktin durch ER zu quantifizieren, haben wir mithilfe von SIM den Bereich der Kolokalisierung von ER (GFP-KDEL) mit ventralen Stressfasern (LifeAct-mCherry) gemessen. Der Bereich der ER- und Aktin-Kolokalisation war in Climp-63-KD-Zellen im Vergleich zu Scramble-siRNA-Zellen ebenfalls verringert (Abb. 5c, d). Der Bereich des ventralen Aktins unterschied sich nicht zwischen Scramble- und Climp-63-siRNA-Zellen (Abb. 5c, e). Die hochauflösende Bildgebung der dorsalen Kernregion zeigte keine Unterschiede in der Fläche des dorsalen ER und der Aktinbedeckung durch ER zwischen Scramble- und Climp-63-siRNA-Zellen (ergänzende Abbildung 5b – d). Diese Beobachtung steht im Einklang mit unseren Beobachtungen, dass Climp-63 weder an der Akkumulation dorsaler ER noch an der Bildung von TAN-Linien beteiligt ist (Abb. 4). Darüber hinaus hatte der Abbau von Climp-63 keinen Einfluss auf die Nesprin-2G-Verteilung in der Kernhülle oder die Kernform (ergänzende Abbildung 6a – e). Darüber hinaus wurde die ER-Menge nicht durch die Erschöpfung von Climp-63 beeinflusst, wie bereits berichtet (ergänzende Abbildung 6f)21. Basierend auf diesen Ergebnissen stellten wir die Hypothese auf, dass die Umhüllung der Aktin-Stressfasern durch das ER als Schutzschild wirken könnte, das die Verankerung des Zellkerns an den unbeweglichen ventralen Stressfasern verhindert. Wenn also in Abwesenheit von Climp-63 keine ER-Umhüllung der Aktin-Stressfasern erfolgt, würde der Zellkern an den unbeweglichen ventralen Stressfasern verankert werden und wäre nicht in der Lage, sich zu bewegen.

a Repräsentative Strukturbeleuchtungsmikroskopie (SIM)-Bilder eines Zeitraffervideos während der Kernbewegung von Wundrand-GFP-KDEL- und LifeAct-mCherry-Fibroblasten, die mit Scramble- und Climp-63-siRNAs behandelt wurden. Pfeile im hervorgehobenen ROI zeigen die ventrale Aktinabschirmung durch ER während der Kernbewegung. b Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen mit ER-Abschirmung der ventralen Aktin-Stressfasern in Zellen, die wie in a mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden. c Repräsentative Strukturbeleuchtungsmikroskopie (SIM)-Bilder von Wundrand-GFP-KDEL- und LifeAct-mCherry-Zellen, behandelt mit Scramble- (grau) und Climp-63-siRNAs (grün). ROI werden hervorgehoben (gelbes Feld) und in 3-facher Vergrößerung dargestellt (rechts). d Quantifizierung der Fläche von ER und Aktin-Kolokalisation pro um2 Aktin pro Kern in Zellen, die mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden, wie in c. e Quantifizierung des nuklearen ventralen Aktinbereichs in Zellen, die mit Scramble- (grau) oder Climp-63-siRNA (grün) behandelt wurden, wie in c. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen Scramble und Climp-63-siRNA berechnet. Die Experimente wurden ≥3 wiederholt. Maßstabsbalken: a, c 5 µm. Fehlerbalken, REM. *p < 0,05.

Um zu testen, ob für die Kernpositionierung eine Umhüllung von Aktin durch das ER erforderlich ist, haben wir zwei Strategien entwickelt, um ER für Aktinfasern in Climp-63-KD-Zellen zu rekrutieren. Es wurde zuvor gezeigt, dass GFP-mini-N2G, dem die luminale Region fehlt (GFP-m-N2GΔL), nicht mit dem LINC-Komplex interagiert und daher im gesamten ER verteilt ist. GFP-m-N2GΔL kann über die N-terminale CH-Domäne12 an Aktin binden. Somit kann GFP-m-N2GΔL ER für das Aktin-Zytoskelett rekrutieren. Wir fanden heraus, dass die Expression durch Mikroinjektion von GFP-m-N2GΔL in Climp-63-KD-Wundrandzellen den ventralen ER-Bereich und die vom ER umwickelten Aktin-Stressfasern auf das gleiche Niveau wiederherstellte wie mit Climp-63 mikroinjizierte Zellen und mit Scramble-siRNA behandelte Zellen (Abb. 6a–c). Auf der dorsalen Seite wurden im Vergleich zu Scramble-siRNA-Zellen keine Unterschiede im ER-Bereich, der dorsalen Aktinumhüllung durch ER und der Bildung von TAN-Linien bei der Expression von GFP-mN2GΔL in Climp-63-siRNA-Zellen beobachtet (Supplementary Abb. 5b – d, Supplementary). Abb. 6g, h). Wichtig ist, dass die Expression von GFP-m-N2GΔL auch die Kernpositionierung auf dem gleichen Niveau rettete wie Zellen, denen Climp-63 mikroinjiziert wurde, und mit Scramble-siRNA behandelte Zellen (Abb. 6d, e).

a Repräsentative konfokale Airyscan-Bilder von Wundrandzellen, die LifeAct-mCherry stabil exprimieren und mit HaloTag-Sec61 zusammen mit GFP-KDEL, GFP-Climp-63 oder GFP-mN2GΔL, GFP-INF2-CAAX und GFP-INF2-nonCAAX mikroinjiziert wurden. Der hervorgehobene ROI (gelbes Feld) stellt die unten dargestellten Einsätze dar. b Quantifizierung der Fläche des ventralen ER in Zellen, die wie in a behandelt wurden. Fehlerbalken, REM. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen den experimentellen Bedingungen und der ersten Bedingung berechnet. c Quantifizierung des Prozentsatzes der von ER abgedeckten Aktinkabelfläche in Zellen, die wie in a behandelt wurden. Fehlerbalken, REM. Die Signifikanz ((Zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen experimentellen Bedingungen und der ersten Bedingung berechnet. d Epifluoreszenz-repräsentative Bilder von Climp-63-siRNA-behandelten Wundrandzellen, denen GFP-KDEL, GFP-mN2GΔL GFP-INF2-CAAX oder mikroinjiziert wurden GFP-INF2-nonCAAX. Zellen wurden wie folgt gefärbt: Aktin (Phalloidin, rot), GFP (grün), DNA (DAPI, blau). e Kernpositionen relativ zum Zellschwerpunkt in Zellen, die wie in d behandelt wurden. Box zeigt erstes Quartil , Median und drittes Quartil sowie Whiskers zeigen 10–90 % Perzentil. Die Signifikanz (zweiseitiger ungepaarter t-Test) wurde zwischen experimentellen Bedingungen und der Scramble-siRNA berechnet. ****p < 0,0001 (siRNA Climp-63 allein, GFP -KDEL), **p < 0,01, *p < 0,05. Experimente wurden ≥3 wiederholt. Maßstabsbalken: a 5 µm, d 10 µm.

Die zweite Strategie, die wir zur Rekrutierung von ER für Aktinfasern verwendeten, beinhaltete Inverted Formin-2 (INF2). INF2 verfügt über zwei Spleißisoformen: CAAX mit Lokalisierung im ER und Nicht-CAAX mit Lokalisierung in fokalen Adhäsionen und Zytoplasma32,33. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Expression von GFP-INF2-CAAX, jedoch nicht von INF2 ohne die CAAX-Domäne (GFP-INF2-nonCAAX), eine Aktinanreicherung um ER34 induziert. In Übereinstimmung mit diesen vorherigen Ergebnissen stellten wir fest, dass die Expression von GFP-INF2-CAAX in Climp-63-siRNA-Zellen den ventralen ER-Bereich, die vom ER umwickelten Aktin-Stressfasern und die Kernpositionierung auf dem gleichen Niveau wie bei mit Climp-63 mikroinjizierten Zellen wiederherstellte und siRNA-behandelte Zellen vermischen (Abb. 6a – e). Andererseits konnte die Überexpression von INF2 ohne die CAAX-Domäne (GFP-INF2-noCAAX) in Climp-63-siRNA-Zellen die Kernpositionierung nicht retten und den ventralen ER-Bereich sowie die Umhüllung der Aktin-Stressfasern durch das ER teilweise wiederherstellen (Abb. 6a). –e). Auf der dorsalen Seite wurden im Vergleich zu Scramble-siRNA-Zellen keine Unterschiede im ER-Bereich, der dorsalen Aktinumhüllung durch ER und der Bildung von TAN-Linien bei der Expression von INF2-Isoformen in Climp-63-siRNA-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 5b – d, ergänzende Abbildung . 6g, h). Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Rekrutierung von ER für ventrales Aktin ausreicht, um die Kernpositionierung in Abwesenheit von Climp-63 zu retten, wahrscheinlich durch Hemmung ventraler Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen.

Die Position des Zellkerns ist ein Kennzeichen der Zellpolarisation, und die meisten Kernpositionierungsmechanismen basieren auf Nukleo-Zytoskelett-Wechselwirkungen5,35,36,37,38,39,40. Hier beschreiben wir, wie das ER asymmetrische Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen erzeugen kann, die für die Kernbewegung erforderlich sind.

Wir fanden heraus, dass Climp-63 für die Kernpositionierung und die ventrale, aber nicht dorsale ER-Akkumulation erforderlich ist. Die Rekrutierung von ER an Aktin stellt die Kernbewegung in Climp-63-depletierten Zellen wieder her. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass in Abwesenheit von Climp-63 die unbeweglichen ventralen Stressfasern nicht von ER umhüllt sind und daher über einen nicht identifizierten Mechanismus mit dem Kern interagieren können, wodurch die Bewegung des Kerns durch dorsale Aktinkabel verhindert wird. Daher kann das ER als Schutzschild für ventrale Nukleo-Zytoskelett-Wechselwirkungen fungieren und eine Kernbewegung ermöglichen, die durch dorsale Aktinkabel angetrieben wird, die mit der Kernhülle verbunden sind (Abb. 7).

Diagramm der sagittalen Ansicht zweier Wundrandzellen, mit der Vorderkante auf der rechten Seite, auf einem Substrat (hellgrau). Obere Zelle: Bei LPA-Stimulation (Kontrolle) bewegt sich der Zellkern von der Vorderkante weg, während sich das ER im perinukleären Bereich ansammelt. Dadurch schirmt das ventrale ER unbewegliche ventrale Stressfasern ab und der Kern bewegt sich von der Vorderkante weg, die mit dorsalen Aktinkabeln verbunden ist. Untere Zelle: In Abwesenheit von Climp-63 kommt es zu einer Verringerung der perinukleären ER-Akkumulation, was zu einer Verringerung der ventralen Stressfasern führt, die durch ER abgeschirmt werden. Daher kann der Kern mit unbeweglichen ventralen Stressfasern interagieren, was zu einem Tauziehen zwischen dorsalen Aktinkabeln, die versuchen, den Kern nach hinten zu bewegen, und ventralen Stressfasern, die den Kern verankern, führt.

Das Wissen über die Rolle von ER-formenden Proteinen bei der ER-Morphologie ist im letzten Jahrzehnt gewachsen. Die Rolle von Kinectin-1 und p180 bei der ER-Verteilung ist immer noch umstritten und könnte vom Zelltyp abhängig sein, es ist jedoch erwähnenswert, dass beschrieben wurde, dass die KD beider Proteine ​​das perinukleäre ER erhöht41,42. Andererseits ist die Rolle von Climp-63 als Regulator der Breite der ER-Blätter und der perinuklearen Akkumulation eher einvernehmlich, und sowohl die luminale als auch die zytoplasmatische Domäne scheinen sie zu regulieren19,21,43. Es wurde auch berichtet, dass Climp-63 KD das perinukleäre ER verringert, was unsere Ergebnisse bestätigt21. Unsere Arbeit legt nahe, dass die luminale Domäne von Climp-63 die ER-Morphologie und -Verteilung sowie die Kernbewegung auf mikrotubuliunabhängige Weise reguliert.

Die Kernbewegung in wandernden Fibroblasten wird durch dorsale Aktinkabel angetrieben, die über Nesprin-2G auf TAN-Leitungen mit der dorsalen Seite des Kerns verbunden sind12,15. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Climp-63 nicht an der Regulierung des dorsalen ER beteiligt ist. Aktin-Rückenkabel und ihre Verbindung zum Zellkern über TAN-Linien, die treibende Kraft der Kernbewegung bei migrierenden Fibroblasten, sind ebenfalls nicht von der Climp-63- und ER-Morphologie abhängig. Unsere Daten legen nahe, dass Aktin-Zytoskelett-Verbindungen, die durch TAN-Linien auf der Rückseite des Kerns vermittelt werden, unabhängig von der ER-Morphologie und möglichen Wechselwirkungen zwischen Aktin und ER sind. Stattdessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Rolle des ER bei der Kernbewegung darin besteht, die unbeweglichen ventralen Stressfasern abzuschirmen und so die Verbindung zwischen dem Kern und den ventralen Stressfasern zu verhindern. Wir schlagen einen Mechanismus zur Hemmung von Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen vor, der die ER-Abschirmung des Aktin-Zytoskeletts beinhaltet. Dieser Mechanismus erzeugt asymmetrische Nukleo-Zytoskelett-Verbindungen, die für die Kernbewegung erforderlich sind, wenn keine asymmetrische Verteilung des LINC-Komplexes vorliegt44. Wir gehen davon aus, dass dieser Mechanismus auch am Wechsel zwischen verankernden und sich bewegenden Kernen in Zellen1,8 und an der Mechanotransduktion45 beteiligt sein kann.

Das ER kontaktiert mehrere Organellen und die Plasmamembran, und diese Kontakte sind an der Lipidverteilung, der Kalziumregulierung und der Organellendynamik beteiligt46,47,48. Hier schlagen wir vor, dass das ER auch als Schutzschild fungieren kann, um Wechselwirkungen zwischen Aktin und dem Zellkern zu verhindern. Wir vermuten, dass diese ER-Funktion an anderen Interaktionen zwischen Zytoskelett und Organellen sowie an ER-Kontakten mit Organellen beteiligt ist.

NIH3T3-Fibroblasten (AATC) wurden in Wachstumsmedium (DMEM ohne Natriumpyruvat; 41965-039, Life Technologies), ergänzt mit 10 % Rinderkalbsserum (Corning, 35-053-CM), 10 mM HEPES (15630056, Life Technologies) kultiviert. und Penicillin/Streptomycin bei 500 Einheiten/ml (15140-122, Life Technologies). U2OS-Zellen (AATC) wurden in Wachstumsmedium (DMEM mit Natriumpyruvat; 41966-029, Life Technologies), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (CVFSVF00-01, Eurobio) und Penicillin/Streptomycin mit 500 Einheiten/ml, kultiviert. Für beide Zelltypen hat das serumfreie Medium die gleiche Zusammensetzung wie das Wachstumsmedium, mit Ausnahme des Rinderkalbsserums oder fötalen Rinderserums. Kleine Interferenz-RNAs (siRNAs) wurden wie zuvor beschrieben10 unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (13778-150, Invitrogen) transfiziert. Nesprin-2G-siRNA wird wie zuvor beschrieben10 von Genecust Europe maßgeschneidert hergestellt. The Scramble (4390843), Climp-63 #1 (s103547), Climp-63 #2 (s103548), p180 (s96290), Kinectin-1 (s69027), Myosin-1C (s70302) und Reticulon-4 (86843) siRNA sind kommerzielle Silencer Select siRNAs von ThermoFisher Scientific. Die Sequenzen der siRNAs sind in der Ergänzungstabelle 1 zu finden. Mikroinjektionen von cDNA wurden wie in 15,49 beschrieben unter Verwendung eines Xenoworks-Mikroinjektionssystems (Sutter Instruments) durchgeführt. Stabile NIH3T3-Fibroblasten-Zelllinien wurden wie in 49 beschrieben erstellt, wobei eine nur Lifeact-mCherry exprimierte und eine zweite Lifeact-mCherry und GFP-KDEL coexprimierte. Lentiviren wurden in HEK293T-Zellen (pLALI-Rückgrat) produziert.

Der Wundheilungstest und die siRNA-Transfektion wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt50. NIH3T3-Fibroblasten wurden in einer 10-cm-Schale bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert. Um den Wundheilungstest zu starten, wurden die Zellen trypsinisiert und in 10 ml Wachstumsmedium resuspendiert und in einer Schale mit 6 Vertiefungen ausplattiert. Jede Vertiefung sollte am Boden ein mit Säure gewaschenes Deckglas enthalten und wurde zunächst mit 1750 µl Wachstumsmedium (631-0851, VWR) gefüllt. Dann wurden 250 µl der resuspendierten Zellen und 500 µl des siRNA-Mixes hinzugefügt, daher beträgt das Endvolumen 2500 µl pro Vertiefung. Der siRNA-Mix enthielt 20 nM siRNA und 5 µl Lipofectamin pro Vertiefung. Man ließ die Zellen 24 Stunden lang wachsen und nach dieser Zeit wurde das Medium gegen Wachstumsmedium ausgetauscht. Nach dem Ersetzen des Mediums ließ man die Zellen weitere 24 Stunden wachsen. Nach diesem Zeitraum hatten die Zellen normalerweise eine Konfluenz zwischen 60 und 75 % und wurden weitere 48 Stunden lang mit serumfreiem Medium serumentzogen. Um die Kernbewegung zu induzieren, wurden die Zellen 96 Stunden nach der siRNA-Transfektion mit einer 20-µl-Pipettenspitze verletzt und mit 10 µM LPA (L7260-1MG, Sigma-Aldrich) stimuliert. Die LPA-Stimulation dauerte in allen Experimenten 2 Stunden, mit Ausnahme der TAN-Linienanalyse, wo sie nur 50 Minuten dauerte. Nach der Stimulation wurden die Zellen entweder für die Immunfluoreszenz fixiert oder für die Live-Bildgebung verwendet. Für Experimente mit Mikroinjektion wurden Zellen verletzt und 2 Stunden lang mit cDNA mikroinjiziert. Erst nach dieser Expressionszeit wurden die Zellen mit LPA stimuliert.

Auf 10-cm-Schalen ausgesäte NIH3T3-Fibroblasten wurden auf Eis gelegt und zweimal mit PBS bei 4 °C gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 300 μl RIPA-Puffer, bestehend aus 1 % Triton Mit einem Zellschaber wurden die Zellen von der Platte gelöst und das Lysat in ein eiskaltes 1,5-ml-Röhrchen überführt. Die Zelllysate wurden dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 13 G zentrifugiert und die Überstände in einem neuen eiskalten 1,5-ml-Röhrchen gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce) in einem Infinite M200 (Tecan)-Mikroplattenlesegerät gemessen. Die gleiche Menge Gesamtprotein wurde in Mini-PROTEAN® TGX 4–15 % vorgefertigte Proteingele (BioRad) geladen und 60 Minuten lang bei 80 Volt laufen gelassen. Proteine ​​aus dem Gel wurden mit dem Trockentransfersystem iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit primären und sekundären Antikörpern untersucht, die in PBS, 0,1 % Tween-20 und 5 % Milch inkubiert wurden. Die verwendeten Primärantikörper waren Kaninchen-Anti-Climp-63 (HPA041143, 1:500, Sigma-Aldrich), Kaninchen-Anti-Vinculin (V9131, 1:500, Sigma-Aldrich), Kaninchen-Myosin-1C (HPA001768, 1:1000, Sigma-Aldrich), Kaninchen-Reticulon-4 (HPA023977, 1:1000, Sigma-Aldrich) und Maus-Tubulin (T6557, 1:1000, Sigma-Aldrich). Als Sekundärantikörper wurden Anti-Kaninchen-HRP (Thermo Scientific Nr. 31460, 1:5000) und Anti-Maus-HRP (Thermo Scientific Nr. 32430, 1:5000) verwendet.

Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und 5 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 in einem Orbitalschüttler permeabilisiert. Primäre und sekundäre Antikörper wurden in PBS mit 10 % Ziegenserum (G9023-10ML, Sigma-Aldrich) verdünnt. Die Zellen wurden mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert und dann dreimal 10 Minuten lang mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubiert, dreimal 10 Minuten lang mit PBS gewaschen und mit Fluoromount-G (Invitrogen) montiert. Die für die Immunfluoreszenz verwendeten Primärantikörper waren: Kaninchen-Anti-β-Catenin (712700, 1:200, Invitrogen), Maus-Anti-Pericentrin (611814, 1:200, BD-Biosciences), Kaninchen-Anti-Nesprin-2G (1:200). , Geschenk von Gregg Gundersen), Kaninchen-Anti-Kinectin-1 (HPA003178, 1:200, Sigma-Aldrich), Kaninchen-Anti-p180 (HPA011924, 1:200, Sigma-Aldrich), Ratten-Anti-Tyrosin-α-Tubulin (YL1 /2) (1:50, European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, UK), Hühner-Anti-GFP (GFP-1020, 1:1000, Aves Labs). Die verwendeten Anti-Ratten-, Anti-Maus-, Anti-Kaninchen- und Anti-Hühner-Sekundärantikörper waren Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555 und Alexa Fluor 647 (1:800, Life Technologies). Mit Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555 (A12379 bzw. A34055, Life Technologies) konjugiertes Phalloidin wurde zum Färben von filamentösem Aktin verwendet (Verdünnung 1:200). Zur Färbung des Zellkerns wurde DAPI verwendet (1:10000, Sigma-Aldrich). Alle verwendeten Antikörper und Sonden sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Für Rettungsexperimente wurde Maus-Climp-63-cDNA (Life Technologies) auf einem pcDNA3.1 + N-eGFP 6,1 Kb-Expressionsvektor synthetisiert. Um die verschiedenen Climp-63-Regionen zu testen, die an der Kernpositionierung beteiligt sind, wurden fünf verschiedene Plasmide synthetisiert: Climp-63 in voller Länge (Climp-63), Transmembrandomäne plus zytoplasmatische Domäne (Cyto), Transmembrandomäne plus luminale Domäne (Lum), ein Phospho- mimetisches Climp-63, dessen Mikrotubuli-Wechselwirkung durch die Mutation von vier zytosolischen Serinresten zu Glutaminsäure (−MT) verhindert wird, und ein phosphodefizientes Climp-63, bei dem die Wechselwirkung durch die Mutation von drei Serinen zu Alaninen, die nicht phosphoryliert werden können, dauerhaft ist (+). MT). Ergänzende Tabelle 3 enthält die Sequenzen der synthetisierten cDNA. Alle Sequenzen weisen stille Mutationen auf, um Resistenz gegen die verwendeten Climp-63-siRNAs zu verleihen. Alle Plasmide enthielten außerdem einen GFP-Tag am N-Terminus. Die zur Erzeugung der stabilen Zelllinie verwendete Lifeact-mCherry-cDNA war ein Geschenk von Olivier Pertz. Das als Kontrolle verwendete GFP-KDEL wurde in einer früheren Veröffentlichung generiert51. GFP-mini-N2G, mCherry-mini-N2G und GFP-mN2GΔL waren ein Geschenk von Gregg Gundersen Lab12. GFP-INF2-CAAX und GFP-INF2-nonCAAX waren Geschenke von Henry Higgs Lab34. Der HaloTag-Sec61 war ein Geschenk von Andrew Moore52. Die Ergänzungstabelle 4 enthält alle für die Mikroinjektion verwendeten Plasmide.

Zellen für FIB-SEM (U2OS) und TEM (NIH3T3) wurden 1 Stunde lang bei 4 °C in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer, pH 7,3, fixiert, der 2,5 % (v/v) Glutaraldehyd und 0,1 % (v/v) Formaldehyd enthielt . Eine Nachfixierungsbehandlung von 1 Stunde (auf Eis) in 1 % (wässrig) Osmiumtetroxid und 30 Minuten Kontrast im Block in 1 % (wässrig) Uranylacetat wurde ebenfalls durchgeführt. Die Dehydratisierung erfolgte unter Verwendung eines Ethanolgradienten (50-70-95-100 %). Die Proben wurden flach in Durcupan-Harz eingebettet und 72 Stunden lang bei 60 °C ausgehärtet.

Für die TEM-Bildgebung wurden zwei Blöcke zusammengeklebt, um ein sagittales Schneiden zu ermöglichen und die Integrität der Probe zu wahren. Die Blöcke wurden mit einem Ultramikrotom Reichert Supernova (Leica microsystems©) geschnitten, ultradünne Schnitte (70 nm) wurden erhalten und in mit Formvar beschichteten Kupferschlitzgittern (AGAR Scientific©) gesammelt und mit Uranylacetat und Bleicitrat gegengefärbt (Reynold-Rezept). Zur Bildaufnahme wurde ein Hitachi H-7650 Transmissionselektronenmikroskop mit 100 kV Beschleunigung verwendet. Für die FIB-SEM-Bildgebung wurden Bilder mit einem Crossbeam 540 (Carl Zeiss) aufgenommen.

Die lichtmikroskopische Bildgebung wurde mit einer Vielzahl von Bildgebungstechniken und Mikroskopen durchgeführt. Für die Immunfluoreszenz zur siRNA-Validierung sowie zur Quantifizierung der Kernpositionierung, des ventralen und dorsalen Aktins und der TAN-Linien wurden Zellen mit einem invertierten Zeiss Cell Observer-Weitfeldmikroskop abgebildet, das von ZEN Blue Edition (Zeiss) gesteuert wurde. Für die siRNA-Validierung und Kernpositionierung verwendeten wir ein Ölobjektiv EC Plan-Neofluar ×40/0,75 M27, während für die Quantifizierung der TAN-Linien ein Ölobjektiv ×63/1,4 Plan-Apochromat DIC M27 verwendet wurde. Die beobachtete Zeiss-Zelle war mit einer sCMOS-Kamera (ORCA-flash4.0 V2, 10 ms/Frame-Streaming-Erfassung, Hamamatsu) und einer LED-Lichtquelle Colibri2 (Zeiss) ausgestattet.

Ein konfokales Umkehrmikroskop mit rotierender Scheibe von Zeiss Cell Observer wurde für die Zeitrafferbildanalyse der Verfolgung der Kernbewegung, des retrograden Aktinflusses und der perinukleären ER-Akkumulation während der Kernpositionierung verwendet. Dieses Mikroskop ist mit einer Kammer mit 37 °C und 5 % CO2 ausgestattet, die für die Mikroskopie lebender Zellen geeignet ist, einer EM-CCD-Kamera (Evolve 512, Photometrics), einem konfokalen Spinning-Disk-Scanner (CSU-x1, Yokogawa) und einer LED-Lichtquelle Colibri2 (Zeiss), ein ×63-Plan-Apochromat-Ölobjektiv (NA = 1,4) mit einem Festkörperlaser 405 nm (maximale Leistung 50 mW) und einem 561-nm-Laser (maximale Leistung 75 mW). Darüber hinaus verfügt dieses Mikroskop über einen Emissionsfilter BP 450/50 425–475 nm und einen Emissionsfilter BP 600/50 575–625 nm.

Strukturelle Beleuchtungsmikroskopie (SIM) wurde zur Analyse und Quantifizierung der ventralen Aktin-Stressfasern verwendet, die von ER während der Live-Bildgebung der Kernpositionierung umhüllt werden, sowie zur Analyse und Quantifizierung des Bereichs des ventralen Kern-ER und der Kolokalisierung, des ventralen ER und des ventralen Aktins. Ti2-E-Mikroskop ausgestattet mit einer ORCA-Flash 4.0 sCMOS-Kamera (Hamamatsu Photonics), N-SIM E-Beleuchtungseinheit, Doppelschichtkonfiguration mit Perfect Focus Unit, Piezo Stage, Ti2-FTQ N-SIM motorisierter Quad-Band-Filterrevolver, Ti2- P-FWB-E Motorisiertes BA-Filterrad und Lasereinheit LU-N3-SIM Lasereinheit 488 nm und 561 nm. Das Mikroskop wurde mit der Software NIS-Elements (Nikon) gesteuert. Es wurde ein CFI SR HP Apochromat TIRF NA 1,49 × 100C Ölobjektiv verwendet.

Konfokale Punktscanmikroskopie wurde zur Analyse der ER-Morphologie sowie zur Analyse und Quantifizierung des Bereichs des nuklearen ventralen ER und der Kolokalisierung, des ventralen ER und des ventralen Aktins verwendet. Es wurden zwei Mikroskope verwendet, das punktabtastende Zeiss LSM 710 (ER-Morphologie) und das LSM 880 (ER-Morphologie, Analyse des ventralen ER und quantitative Analyse des ventralen Bereichs des ER und der Aktin-Kolokalisation, ER und Aktin). Das Zeiss LSM 710 ist mit einem 63/1,4 Plan-Apochromat DIC M27 Ölobjektiv, einer 37 °C-Kammer und 5 % CO2 für Live-Bildgebung, einem Diodenlaser 405-30 (405 nm) und einem Argonlaser (458, 488 und 514 nm) ausgestattet ), DPSS 561-10-Laser (561 nm) und HeNe633-Laser (633 nm) und wird mit der Zen Black-Software gesteuert. Das Zeiss LSM 880 ist ein konfokales Umkehrmikroskop mit Punktabtastung, das mit einer 37 °C-Kammer, 5 % CO2 und Definite Focus für die Lebendzellmikroskopie ausgestattet ist. Dieses Mikroskop wird mit ZEN Black (Zeiss) gesteuert und war mit einem Airyscan-Detektor mit 32-Kanal-Bereich (Auflösung von 140 nm lateral und 400 nm axial, bei 488 nm) und einem GaAsP-Detektor (Photomultiplier 45 % QE) und einem 488 nm ausgestattet Argon-Lasereinheit (maximale Leistung 25 mW). Für die Live-Bildgebung wurde ein Deckglashalter verwendet (CM-S22-1 und CM-B25-1, Live Cell Instrument Co). Wir verwendeten ein 63x Plan-Apochromat Oil NA 1.4 Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 0,19 mm und es wurden Z-Stapel von 220 nm aufgenommen.

Die Bilder wurden mit ImageJ vorverarbeitet, um interessante Regionen auszuwählen. Jede Zeile hatte eine Größe von etwa 300 × 300 Pixel. Vor der Segmentierung wurde ein 3D-Medianfilter angewendet, um Salz- und Pfefferrauschen zu entfernen. Um ein 3D-Modell der komplexen Struktur des ER zu erstellen, haben wir die Struktur zunächst mithilfe des Carving-Algorithmus in Ilastik segmentiert. Die Segmentierung wurde iterativ neu definiert und das endgültige Netz wurde mit Blender exportiert und gerendert. Die Originalbilder wurden mit Neuromorph der gerenderten Struktur überlagert. Jede Scheibe war 8 nm dick. Die repräsentativen Bilder sind verschiedene Schnitte der Probe mit einem räumlichen Intervall von 560 nm in Z.

FIB-SEM-Daten wurden mithilfe der Stereologie wie in Lit. beschrieben quantifiziert. 53. Um das Volumen abzuschätzen, wurden 18 Scheiben des gesamten Stapels (entsprechend einem Gesamtvolumen von 0,60 µm3) verwendet (1 Bild alle 10 in einem Stapel von 180 Scheiben). Mit ImageJ wurde ein Raster aus Testpunktsonden mit einem zufälligen Versatz auf die Bilder angewendet, die Anzahl der Punkte, die auf dem ER landeten, manuell gezählt und das Volumen mit Cavalieris Schätzer berechnet.

Die nukleare Positionierung wurde mithilfe einer automatisierten Software quantifiziert, die von Gregg Gundersens Labor, Cell Plot, entwickelt wurde (http://www.columbia.edu/~wc2383/software.html). Die Polaritätsachse stimmt mit der Wickelrichtung überein. Die Koordinaten der Kern- und Zellschwerpunkte werden von der Software automatisch vorgegeben. Die Software berechnet die Kernpositionierung als Abstand zwischen Kernschwerpunkt und Zellschwerpunkt. Dieser Abstand wird in Boxplots mit Whiskers dargestellt, die 10 bis 90 Perzentilen des Prozentsatzes des Zellradius entsprechen.

Bilder markierter Kerne (DAPI) wurden manuell mit Bild J segmentiert und entsprechende 2D-Regionen wurden extrahiert, um Rundheit, Zirkularität und Umfang zu messen.

Rundheit ist ein Maß zur Erfassung von Forminformationen. Die Kernrundheit wurde mit der Formel (4 ∗Fläche)/(π*Hauptachse²) berechnet, wobei die Hauptachse durch Anpassen einer Ellipse an die Kernform berechnet wurde54. Die Kernzirkularität erfasst die Glätte des Umfangs und nicht die gesamte Strukturform. Sie wurde nach folgender Formel berechnet: 4 *π*(Fläche/Umfang2)55. Der Umfang wurde anhand der Länge der Außengrenze der Auswahl (Kern) berechnet.

Die Kernverfolgungsanalyse basierte auf Zeitraffermikroskopie. Während der 120-minütigen LPA-Stimulation wurden die Zellen alle 5 Minuten mit einer rotierenden Scheibe abgebildet. Stabile Zellen, die GFP-KDEL exprimieren, wurden verwendet, um die Kernposition in jedem Frame zu bestimmen. Für die Quantifizierung der nuklearen Verfolgung wurde das Manual Tracking-Plugin von Image J verwendet. Für diese Analyse wurden die Koordinaten des Kernschwerpunkts zu jedem Zeitpunkt gemessen. Die Kernverfolgungsdiagramme, die Persistenz und die JJ-Persistenz wurden mit dem Chemotaxis and Migration Tool (Ibidi) berechnet. Persistenz entspricht der Direktheit und YY-Persistenz entspricht dem parallelen Vorwärtsmigrationsindex im Chemotaxis and Migration Tool.

Einzelne Bilder von lebenden Wundrand-Fibroblastenzellen, die GFP-KDEL exprimieren, wurden zwischen 1 Stunde und 15 Minuten nach der LPA-Stimulation in einem konfokalen Punktscanmikroskop Zeiss LSM 880 aufgenommen. Ein ROI einschließlich der Gesamtfläche der Zelle wurde gezeichnet und die mittlere Intensität von GFP-KDEL quantifiziert.

Um die ER-Morphologie und die perinukleäre ER-Verdichtung zu analysieren, wurden einzelne Bilder lebender Zellen, die GFP-KDEL exprimieren, zwischen 1 Stunde und 15 Minuten nach der LPA-Stimulation in einem konfokalen Punktscanmikroskop Zeiss LSM 880 aufgenommen. Für Zellen, die nicht mit LPA behandelt wurden, wurde die Bildgebung 1 Stunde und 45 Minuten nach dem Kratzen der Wunde durchgeführt. Repräsentative Bilder stellen ein einzelnes Z dar. Für beide Experimente wurde die Bildgebung bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt.

Um die perinukleäre ER-Akkumulation zu analysieren, wurde die KDEL-GFP-Fluoreszenzintensität im ventralen, perinukleären und dorsalen Bereich der Zelle gemessen. Sowohl für den ventralen als auch für den dorsalen Bereich wählten wir eine Z-Ebene, in der wir das ventrale ER erkennen konnten, und wählten einen ROI, der nur den Kernbereich umfasste, und die Fluoreszenzintensität wurde gemessen. Um die Intensität zu normalisieren, wurde jede Fluoreszenzintensität auf die Gesamtintensität der Zelle zu jedem Zeitpunkt normalisiert. Das gleiche Verfahren wurde zur Messung des ventralen und dorsalen ER verwendet. Um das perinukleäre ER zu messen, wurde ein Linienscan um den Kern herum verfolgt und jeder Linienscan hatte eine Dicke von 3 µm. Die mittlere GFP-Fluoreszenzintensität wurde entsprechend der gesamten GFP-Intensität der Zelle zu jedem Zeitpunkt normalisiert.

Zur Analyse des ventralen und dorsalen filamentösen Aktins haben wir Bilder von Wundrandzellen aufgenommen, die 2 Stunden lang mit LPA stimuliert, fixiert und mit Phalloidin-Alexa Fluor 647 gefärbt wurden, wobei der Schwerpunkt auf der dorsalen und ventralen Seite der Zellen lag. Anschließend haben wir die Anzahl der ventralen Spannungsfasern und dorsalen Aktinkabel pro Kern ermittelt.

Zur Quantifizierung der TAN-Linien wurde GFP-mini-N2G in an den WT-Wundrändern ausgehungerte Zellen mikroinjiziert, und nach 2-stündiger Expression wurden die Zellen 50 Minuten lang mit LPA stimuliert. Die Zellen wurden fixiert und auf GFP immunmarkiert und mit Phalloin-Alexa 647 auf filamentöses Aktin gefärbt. Wir quantifizierten die Anzahl der TAN-Linien pro Kern (Anzahl der kolokalisierenden Linien von Nesprin-2G und dorsalen Aktinkabeln) und den Prozentsatz der Kerne mit TAN-Linien ( Prozentsatz der Kerne mit mindestens einer TAN-Linie).

Um den retrograden Aktinfluss zu analysieren, führten wir eine Zeitraffermikroskopie von Wundrandzellen durch, die stabil mit Lifeact-mCherry transfiziert und mit LPA stimuliert wurden. Die Bilder wurden alle 5 m während 2 Stunden aufgenommen. Wir haben Kymographen unter Verwendung rechteckiger Bereiche senkrecht zum Wundrand erstellt, von der Vorderkante bis zur Rückseite des Zellkerns (2,3 µm breit).

Um die retrograde Fließgeschwindigkeit von Aktin zu berechnen, verwendeten wir Trigonometrie. Um die räumliche Verschiebung zu berechnen, begannen wir zunächst damit, eine Linie auf dem Kymographen vom ersten bis zum letzten Zeitpunkt zu zeichnen, wo wir sie kontinuierlich visualisieren konnten. Die tatsächliche räumliche Verschiebung des Aktinkabels entspricht jedoch der Entfernung in Y von der Koordinate des ersten Zeitpunkts bis zum letzten Zeitpunkt (gegenüberliegende Spannzange). Um die Gegenkathete zu berechnen, haben wir die Hypotenuse (den Abstand zwischen dem ersten und dem letzten Zeitpunkt) mit dem Sinus des Winkels zwischen der Hypotenuse und der Vorderkante multipliziert. Die zeitliche Dauer der Aktinkabelverschiebung in Minuten entspricht der Anzahl der Zeitpunkte, an denen wir sie visualisieren, multipliziert mit 5. Darüber hinaus haben wir auch den Prozentsatz der Zellen quantifiziert, in denen sich der Fluss vorwärts, rückwärts oder überhaupt nicht bewegte. Aktinkabel, die sich zur Vorderkante hin bewegten, galten als vorwärts, Aktinkabel, die sich zur Zellrückseite bewegten, galten als rückwärts und Aktinfilamente, die sich nicht bewegten, galten als gestoppt.

Um zu analysieren, wie Climp-63 die ER-Umhüllung von Aktin-Stressfasern während der Kernpositionierung beeinflusst, wurden Zellen, die Lifeact-mCherry und GFP-KDEL koexprimieren, mit LPA stimuliert und mit Zeitraffermikroskopie abgebildet. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt Null stimuliert und das erste Bild wurde zum Zeitpunkt 60 Minuten erfasst. 60 Minuten lang wurde alle 15 Minuten ein Bild aufgenommen. Zu jedem Zeitpunkt wurde ein AZ-Stapel von 1 µm mit einem Z-Schritt von 120 nm erfasst. Um den ventralen Bereich der ER- und Aktin-Kolokalisation zu analysieren, wurden außerdem ER und Aktin unter den Kernzellen nach 1 Stunde LPA-Stimulation abgebildet und Z-Stapel in einzelnen Schnappschüssen erfasst (LSM 880 und SIM). SIM-Mikroskopieexperimente wurden mit dem ×100-Objektiv von Nikon N-SIM E bei 37 °C durchgeführt und die Zellen wurden mit HEPES bei 20 mM behandelt, um den pH-Wert während der Aufnahme zu stabilisieren. Die Bildanalyse wurde mit ImageJ durchgeführt.

Der Prozentsatz der Zellen mit Aktin-Abschirmung durch ER wurde manuell aus Z-Stapeln von Bildern von ventralem Aktin und ER quantifiziert. Zellen wurden als positiv bewertet, wenn zu mindestens zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten mindestens ein Ereignis beobachtet wurde, bei dem ER einen Haken bildete oder sich um Aktin-Stressfasern wickelte.

Der Bereich der ventralen ER- und Aktin-Kolokalisation wurde in Zellen gemessen, die GFP-KDEL oder HaloTag-Sec61 exprimierten, markiert mit Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligand (Promega, #GA1120) (zur Markierung des ER) und LifeAct-mCherry (zur Markierung von Aktinfilamenten). ). Eine dem Kern entsprechende Maske wurde verwendet, um ventrales ER und Aktin auszuwählen. ER-Bilder waren Schwellenwerte und eine binäre Maske wurde erstellt. Aktinfilament-Binärmasken wurden manuell generiert. Die überlappende Fläche zwischen ER- und Aktinfilamenten wurde mit dem Bildrechner in Bild J berechnet. Die Kolokalisationsfläche wurde für die Fläche des ventralen Aktins pro Kern normalisiert. Um den Prozentsatz des von ER bedeckten Aktinkabels zu quantifizieren, wurde das Verhältnis zwischen der Fläche von ER und der Fläche des Aktinkabels berechnet.

Um die Lokalisierung von Climp-63 zu analysieren, wurden Climp-63-siRNA-Zellen mit HaloTag-Sec61 und Climp-63-GFP mikroinjiziert. Um die Fläche von Climp-63 pro gesamter ER-Fläche zu quantifizieren, wurde das Verhältnis zwischen Sec61-Fläche und Climp-63-Fläche berechnet. Zur Erstellung der Färbemasken wurde die Schwellenwertmethode verwendet. Die Quantifizierung erfolgte sowohl im ventralen als auch im dorsalen Bereich der Zelle.

Rettungsexperimente wurden durchgeführt, um die Kernpositionierung durch Mikroinjektion verschiedener Konstrukte in verwundete Vorderkanten-Scramble- und Climp-63-depletierte Zellen zu retten. Die Zellen wurden nach 48 Stunden Hunger mikroinjiziert und die cDNA wurde 2 Stunden lang vor der LPA-Stimulation exprimiert. Nach 2 Stunden LPA-Stimulation wurden die Zellen fixiert und zur Quantifizierung der Kernpositionierung gefärbt. Um die Relevanz der verschiedenen Climp-63-Domänen für die Kernpositionierung zu testen, wurden Climp-63-abgereicherte Zellen mit KDEL (Kontrolle), Climp-63 in voller Länge, Climp-63-Zytoplasmadomäne (Cyto) und Climp-63-Luminaldomäne (Lum) mikroinjiziert ), Climp-63 (−) MT und Climp-63 (+) MT. Um zu testen, ob die Wirkung der Climp-63-Depletion auf den Verlust von ER-Actin-Interaktionspunkten zurückzuführen ist, wurden Climp-63-depletierte Zellen mit GFP-KDEL (Kontrolle) mikroinjiziert, wobei GFP-mini-N2G die KASH-Domäne (m-N2GΔL) fehlte. , GFP-INF2-CAAX und GFP-INF2-nonCAAX. Um sicherzustellen, dass der siRNA-Knockdown bei jedem mikroinjizierten Deckglas, bei dem die Kernpositionierung quantifiziert wurde, effizient war, wurde die Kernpositionierung in nicht mikroinjizierten Zellen gemessen und Deckgläser, bei denen die siRNA-Transfektion ineffizient war, wurden ausgeschlossen.

ImageJ FIJI-Software (verfügbar unter https://fiji.sc/). Fiji-Software wurde als Bildverarbeitungssoftware und zur Quantifizierung der perinuklearen ER-Akkumulation verwendet; TAN-Linien; retrograde Aktin-Flussrichtung; ventrales und dorsales Aktin; Bereich der ventralen nuklearen ER- und Aktin-Kolokalisation, ER und Aktin; nukleare Verfolgung während der nuklearen Bewegung; ER-Lumenbreite, ER-Fläche, Kernhüllen-Lumenbreite; Nesprin-2G mittlere Fluoreszenz. Zum Zusammenstellen der Figurentafeln wurde Adobe Illustrator verwendet.

Zur Analyse und Darstellung der Daten wurde die Software Graphpad Prism 8 verwendet. Ungepaarte Vergleiche wurden mit dem Student-t-Test durchgeführt, wobei von der gleichen Varianz für beide Populationen und einer Gauß-Verteilung ausgegangen wurde (zweiseitiger ungepaarter t-Test). Die Verteilung der Datenpunkte wird als Mittelwert ± SEM aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten ausgedrückt und die Linie gibt den Mittelwert an. Es wurden keine Ausreißer entfernt. Repräsentative Bilder stammen aus mindestens drei Experimenten, mit Ausnahme der FIB-SEM- und EM-Bildgebung, bei der in insgesamt einem Experiment eine Zelle pro Behandlung erfasst wurde. P-Werte werden wie folgt dargestellt: ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Alle FIB-SEM-Daten sind bei EMPIAR unter den Zugangscodes EMPIAR-11002 und EMPIAR-11003 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Henry Higgs, Andrew Moore, Alexander Palazzo und Gregg Gundersen für die Reagenzien. Wir danken allen Mitgliedern der Laboratorien Edgar Gomes, Cláudio Franco und Vanessa Morais sowie Bruno Cadot, Sérgio Dias und Florence Janody für Diskussionen und Unterstützung. Wir danken der gesamten iMM-Community für die Unterstützung. Wir danken den folgenden iMM-Einrichtungen; Bioimaging, vergleichende Pathologie, Durchflusszytometrie, Nagetier und Zebrafisch. Wir danken der Electron Microscopy Core Facility am EMBL, insbesondere Yannick Schwab. Wir danken Guy Riddihough (Life Science Editors) für seine Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken Nikon Instruments für die Leihgabe der Ausrüstung. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat H2020-GA 810207-ARPCOMPLEXITY und FP7-GA 617676 PHONICS (ERG), EMBO-Installation (ERG), Marine Biological Laboratory Whitman Centre Fellowship (ERG), Association pour la Recherche sur le Cancer und La unterstützt Ligue Nacionale contre le Cancer (ERG) und Fundação para a Ciência ea Tecnologia (SFRH/BD/112286/2015)(CJ), European Research Council H2020-GA 679368 AXIAL.EC (CF); Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/MED-PAT/31639/2017; CEECIND/04251/2017)(CF) und Fondation LeDucq (17CVD03)(CF).

Andreia Pinto

Derzeitige Adresse: Royal Brompton Hospital und Harefield NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Anna Pezzarossa & Pedro Campinho

Derzeitige Adresse: Champalimaud-Stiftung, Champalimaud-Zentrum für das Unbekannte, Lissabon, Portugal

Pedro Machado

Aktuelle Adresse: Centre for Ultrastructural Imaging, King's College London, London, Großbritannien

João Lobo Antunes Institut für Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät, Universität Lissabon, Lissabon, Portugal

Cátia Silva Janota, Andreia Pinto, Anna Pezzarossa, Judite Costa, Pedro Campinho, Cláudio A. Franco und Edgar R. Gomes

Electron Microscopy Core Facility (EMCF), Europäisches Labor für Molekularbiologie, Heidelberg, Deutschland

Pedro Machado

Institut für Histologie und Entwicklungsbiologie, Medizinische Fakultät, Universität Lissabon, Lissabon, Portugal

Cláudio A. Franco und Edgar R. Gomes

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CSJ und ERG haben die Experimente konzipiert und gestaltet. CSJ führte die Experimente mit Ausnahme des FIB-SEM- und TEM-Versuchsverfahrens durch. Die FIB-SEM-Erfassung wurde von JC, A.Pi. durchgeführt. und PM, das 3D-Rendering und die Quantifizierung der FIB-SEM-Daten, die von A.Pe durchgeführt wurde. Die von A.Pi., CSJ und ERG durchgeführte TEM-Probenvorbereitung und Bildaufnahme analysierte die Daten. CSJ und ERG haben das Manuskript geschrieben. PC und CAF stellten unveröffentlichte Daten zur Verfügung. Alle Autoren beteiligten sich an der kritischen Prüfung und Überarbeitung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Edgar R. Gomes.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Janota, CS, Pinto, A., Pezzarossa, A. et al. Die Abschirmung von Aktin durch das endoplasmatische Retikulum beeinflusst die Kernpositionierung. Nat Commun 13, 2763 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30388-3

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Eingegangen: 14. Oktober 2021

Angenommen: 28. April 2022

Veröffentlicht: 19. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30388-3

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