Lichtanpassung verhindert nicht frühe Netzhautanomalien bei diabetischen Ratten

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 21075 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Die Ätiologie der diabetischen Retinopathie (DR), der häufigsten Erblindungsursache in der entwickelten Welt, bleibt umstritten. Eine Hypothese besagt, dass die Netzhauthypoxie, die durch den hohen O2-Verbrauch der Stäbchenphotorezeptoren im Dunkeln verstärkt wird, eine Hauptursache für DR ist. Basierend auf dieser Vorhersage untersuchten wir, ob frühe Netzhautanomalien bei Streptozotocin-induzierten diabetischen Ratten gelindert werden, indem die Stäbchen daran gehindert werden, sich an die Dunkelheit anzupassen. Diabetische Ratten und ihre nicht-diabetischen Wurfgeschwister wurden in einem 12:12-Stunden-Licht-Dämpfungs-Photozyklus (30 Lux tagsüber und 3 Lux nachts) gehalten. Das Fortschreiten früher Netzhautanomalien bei diabetischen Ratten wurde durch Überwachung der ERG-B-Wellen- und Oszillationspotentiale, der reaktiven Müller-Zell-Gliose und des neuronalen Zelltods beurteilt, die durch TUNEL-Färbung und Netzhautdicke 6 und 12 Wochen nach der Diabetes-Induktion bestimmt wurden. Das Halten diabetischer Tiere in einem sich an die Dunkelheit anpassenden Licht verlangsamte das Fortschreiten dieser neuronalen und glialen Veränderungen nicht im Vergleich zu diabetischen Ratten, die in einem Standard-Hell-Dunkel-Photozyklus von 12:12 Stunden gehalten wurden (30 Lux am Tag und 0 Lux in der Nacht). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass neuronale und gliale Anomalien in frühen Stadien von Diabetes nicht durch den O2-Verbrauch von Stäbchenphotorezeptoren im Dunkeln verschlimmert werden.

Diabetische Retinopathie (DR) ist eine schwerwiegende Komplikation sowohl von Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes und eine der Hauptursachen für Sehbehinderung und Blindheit1. Angesichts der aktuellen Epidemie von Typ-2-Diabetes wird DR in den kommenden Jahrzehnten zu einem noch ernsteren Gesundheitsproblem werden.

Die ersten Schritte, die zur DR führen, sind noch nicht vollständig geklärt. Eine Hypothese zur Ätiologie der DR besagt, dass eine beeinträchtigte Durchblutung in frühen Stadien der Erkrankung zu einer Netzhauthypoxie führt. Obwohl die Beweise für Hypoxie bei DR umstritten sind, stützen einige Studien die Hypothese. In psychophysischen Experimenten an Diabetikern werden eine verminderte Kontrastempfindlichkeit und eine verminderte Farbwahrnehmung wiederhergestellt, wenn die Patienten 100 % O22,3 einatmen. In Tiermodellen für Diabetes weisen die Pimonidazol-Markierung4, die Expression des Hypoxie-induzierbaren Faktors 15 und die intraretinalen PO2-Profile bei seit 6 Jahren diabetischen Katzen6 allesamt auf eine retinale Hypoxie hin.

GB Arden hat vorgeschlagen, dass der hohe Stoffwechselbedarf von Photorezeptoren im Dunkeln die Netzhauthypoxie verschlimmert und eine Hauptursache für DR7 sein könnte. Er hat vorgeschlagen, dass die Verhinderung der Dunkelanpassung der Stäbchenphotorezeptoren, die ihren Stoffwechselbedarf deutlich reduzieren würde, die Hypoxie verringern und das Fortschreiten der DR verlangsamen könnte. Zur Untermauerung dieser Hypothese hat Arden in vorläufigen Versuchen an Diabetikern herausgefunden, dass die nächtliche Lichtexposition, um die Anpassung der Stäbchen an die Dunkelheit zu verhindern, bei Diabetikern zu einer Verbesserung der Sehfunktion und einem Rückgang des Makulaödems führt8,9.

Diabetische Retinopathie wird traditionell als Erkrankung des Netzhautgefäßsystems angesehen. Es gibt jedoch starke Hinweise darauf, dass neuronale und gliale Dysfunktionen offensichtlichen Gefäßläsionen vorausgehen und eine Rolle bei der Entwicklung von DR10 spielen. Sowohl bei Patienten als auch in Tiermodellen von Diabetes kommt es zu einem Verlust von Netzhautneuronen zu Beginn des Krankheitsverlaufs11. Neuronale Dysfunktionen spiegeln sich in Veränderungen im Elektroretinogramm (ERG) wider12,13. Darüber hinaus werden als Reaktion auf eine Netzhauthypoxie Müller-Zellen (die wichtigsten Gliazellen der Netzhaut) aktiviert und regulieren proangiogene und vaskuläre Permeabilitätsfaktoren wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) hoch10,14, was zur Entwicklung klinischer Symptome beitragen kann einer Retinopathie.

Wir haben nun untersucht, ob die Verhinderung der Dunkeladaptation frühe neuronale und gliale Veränderungen in der diabetischen Netzhaut in einem Rattenmodell für Typ-1-Diabetes reduziert. Wir stellen fest, dass die Verhinderung der Anpassung an die Dunkelheit durch das Halten von gedämpftem Licht bei diabetischen Ratten während der Nacht das Fortschreiten früher Netzhautanomalien nicht verlangsamt, was durch Veränderungen im ERG, reaktive Müller-Zell-Gliose und neuronalen Zelltod, bestimmt durch TUNEL-Färbung, beurteilt wird Netzhautdicke.

Wir haben die Hypothese, dass die Verhinderung der Dunkeladaption das Fortschreiten früher Netzhautanomalien bei diabetischen Ratten verlangsamt, anhand des Streptozotocin (STZ)-Tiermodells für Typ-1-Diabetes getestet. Sprague-Dawley-Ratten wurden mit einer einzigen Injektion von STZ oder Citratpuffer behandelt und der Serumglukosespiegel wurde wöchentlich bestimmt. Mit STZ behandelte Ratten entwickelten innerhalb von 3 Tagen nach der Injektion eine Hyperglykämie und die Glukosekonzentrationen blieben während der gesamten Studie erhöht (Tabelle 1). Die Ratten wurden in einem 12:12 Hell-Dunkel- oder Hell-Dämpfungslicht-Photozyklus gehalten. Tiere, die unter Standard-Hell-Dunkel-Bedingungen gehalten wurden, wurden bei 30 Lux–0 Lux gehalten, während Tiere, die unter dunklen Anpassungsbedingungen gehalten wurden, bei 30 Lux–3 Lux gehalten wurden. Die Ratten wurden 6 und 12 Wochen nach der Diabetes-Induktion auf das Fortschreiten von Netzhautanomalien untersucht.

Ratten, die unter Bedingungen mit Anpassung an die Dunkelheit gehalten wurden, wurden während der subjektiven Nacht in einem Raum mit einer Umgebungslichtintensität in den Käfigen von 3,0 ± 0,9 Lux gehalten, um eine Dunkeladaption der Stäbchenphotorezeptoren zu verhindern. Wir beurteilten, ob eine 3-Lux-Beleuchtung ausreichte, um die Stäbchen an das Licht anzupassen, indem wir Änderungen im ERG bei unterschiedlichen Hintergrundbeleuchtungsstärken maßen.

Flash-ERGs wurden bei Kontrollratten (nicht-diabetisch) im Dunkeln (0 Lux) und bei drei Hintergrundlichtintensitäten (0,3, 3 und 30 Lux) aufgezeichnet. Sowohl die A-Welle als auch die B-Welle wurden bei Hintergrundlichtstärken von nur 0,3 Lux deutlich reduziert (Abb. 1a–c), was zeigt, dass dieses sich an die Dunkelheit anpassende Beleuchtungslicht die Netzhaut anpasst.

(a) ERG-Reaktionen auf Blitzreize von 1,50 log cd.s/m2, aufgezeichnet unter dunkeladaptierten (0 Lux-Hintergrund) und gedämpften und lichtadaptierten Bedingungen (Hintergrundlichtintensitäten von 0,3, 3 und 30 Lux). (b,c) Intensitäts-Antwort-Beziehungen für die a-Welle (b) und die b-Welle (c) unter verschiedenen Hintergrundbeleuchtungsbedingungen. N = 5 Ratten. Hintergrundlichtstärken ab 0,3 Lux passen sich der Netzhaut an. ***P < 0,001 für mehrere Vergleiche zwischen „0 Lux“ und Hintergrundlichtintensitäten von 0,3, 3 und 30 Lux. Fehlerbalken geben hier und in anderen Abbildungen ± Sem an

Wir untersuchten das Fortschreiten von durch Diabetes verursachten Netzhautanomalien bei Ratten, die unter normalen und an schwaches Licht angepassten Lichtbedingungen gehalten wurden. Gemessen wurden Veränderungen im ERG, reaktive Müller-Zell-Gliose, neuronale Apoptose und eine verringerte Netzhautdicke, ein Maß für den Zellverlust der Netzhaut.

Die ERG-B-Welle, die die bipolare Zellfunktion widerspiegelt, und die Oszillationspotentiale (OPs), die hauptsächlich die Aktivität von Amakrinzellen15 widerspiegeln, wurden aufgezeichnet. Diese ERG-Potentiale zeigen charakteristische Veränderungen in frühen Stadien der Netzhautpathologie bei Diabetikern und bei diabetischen Tieren12,13. Unsere Ergebnisse stimmten mit früheren Studien überein. Bereits 6 Wochen nach der Diabetes-Induktion kam es im Vergleich zu Kontrollratten gleichen Alters zu einer signifikanten Verringerung der Amplitude der an Licht und Dunkelheit angepassten B-Welle (Abb. 2a – d). Darüber hinaus zeigten diabetische Ratten ab der 6. Diabeteswoche signifikant verzögerte OP-Reaktionen (Abb. 2e, f).

Die linken Felder zeigen repräsentative ERG-Wellenformen von seit 12 Wochen diabetischen Ratten (rote Spuren) und altersangepassten Kontrollen (schwarze Spuren), die unter Standardlichtbedingungen gehalten wurden. Die rechten Felder zeigen zusammenfassende Intensitäts-Reaktionsbeziehungen. (a,b) Lichtadaptierte Netzhäute. Die Reaktionen in (a) beziehen sich auf einen Blitz mit 2,17 log cd.s/m2. B-Wellen-Amplituden sind in (b) dargestellt. (c,d) Dunkeladaptierte Netzhäute. Die Reaktionen in (c) beziehen sich auf einen Blitz mit 1,50 log cd.s/m2. B-Wellen-Amplituden sind in (d) dargestellt. (e,f) Oszillationspotentiale. Die Reaktionen in (e) beziehen sich auf einen Blitz mit 1,50 log cd.s/m2. Die Summe der Oszillationspotentiale bis zum Höhepunkt (TTP) für OP1 bis OP4 ist in (f) dargestellt. In den rechten Feldern sind seit 6 und 12 Wochen diabetische Ratten (Db) und altersentsprechende Kontrollen (Ctrl) untergebracht Es werden Standardlichtbedingungen (0 Lux, durchgehende Linien) oder an die Dunkelheit angepasste Bedingungen (3 Lux, gestrichelte Linien) angezeigt. Diabetische Ratten hatten im Vergleich zu Kontrollen sowohl in der 6. als auch in der 12. Diabeteswoche verringerte B-Wellen-Amplituden und eine erhöhte Latenz von OPs. Die Wohnbedingungen (Standard vs. Anpassung an die Dunkelheit) hatten keinen Einfluss auf die B-Wellen-Amplitude oder die Verzögerung des Oszillationspotentials. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Ratten an. §, nicht signifikant für den Vergleich zwischen Diabetikergruppen; *P < 0,05, zum Vergleich zwischen jeder Diabetikergruppe und der altersentsprechenden Kontrolle. ##P < 0,01 und ###P < 0,001 zum Vergleich zwischen Standard-Diabetikerratten nach 6 und 12 Wochen. xP < 0,05 und xxxP < 0,001 für den Vergleich zwischen Kontrollgruppen nach 6 und 12 Wochen (Standard in (b) und schwach angepasst in (d)).

Es gab jedoch keine Unterschiede in den ERG-Reaktionen zwischen diabetischen Ratten, die unter Standard- und schwach angepassten Lichtbedingungen gehalten wurden. Die Veränderungen der B-Wellen-Amplituden und der OP-Verzögerungen waren in beiden Tiergruppen ähnlich.

Die reaktive Müller-Zell-Gliose ist ein Kennzeichen einer Netzhauterkrankung und wird bei Diabetikern und in Tiermodellen für Diabetes beobachtet5,16. Wir untersuchten die Expression des Zwischenfilaments, des fibrillären sauren Glia-Proteins (GFAP), in Querschnitten der Netzhaut, um das Fortschreiten und den Schweregrad der Müller-Zell-Reaktivität zu bewerten.

Müller-Zell-Gliose, erkennbar an einer Hochregulierung von GFAP, trat nach 6 Wochen Diabetes in der zentralen und mittleren Netzhaut und nach 12 Wochen in der peripheren Netzhaut auf (Abb. 3). Kontrolltiere (nicht diabetisch) zeigten wenig Gliose. Allerdings war der Prozentsatz der Müller-Zellen, die GFAP exprimierten, bei diabetischen Ratten, die unter Standard- und schwachen Lichtbedingungen gehalten wurden, ähnlich.

(a) Immunhistochemische Markierung für das Müller-zellspezifische Enzym Glutaminsynthetase (GS, rot) und für GFAP (grün) von seit 12 Wochen diabetischen Ratten (untere Bilder) und altersentsprechenden Kontrollen (obere Bilder), die unter Standardlichtbedingungen gehalten wurden. Die Kernfärbung DAPI ist blau dargestellt. In Kontrollnetzhäuten zeigten Müller-Zellen nur eine geringe Markierung für GFAP, wobei die Expression auf Astrozyten (Pfeile) an der Netzhautoberfläche und entlang durchdringender Gefäße beschränkt war. Bei diabetischen Ratten zeigten Müller-Zellen eine erhöhte Gliose (GS-positive Prozesse, die auch GFAP-positiv waren; Pfeilspitzen). Hierzu und Abb. 4, GCL, Ganglienzellschicht; IPL, innere plexiforme Schicht; INL, innere Kernschicht; OPL, andere plexiforme Schicht, ONL, äußere Kernschicht; PL, Photorezeptorschicht. Maßstabsbalken: 50 μm. (b) Zusammenfassende Daten für Müller-Zell-Gliose (Prozentsatz der GS-positiven Prozesse im IPL, die auch GFAP-positiv waren) nach 6 und 12 Wochen in der peripheren, mittleren und zentralen Netzhaut bei Kontroll- (Ctrl) und diabetischen Ratten (Db). unter Standardbedingungen (0 Lux) oder an die Dunkelheit angepassten Bedingungen (3 Lux). Müller-Zellen in der mittleren und zentralen Netzhaut zeigen eine erhöhte Gliose in der 6. und 12. Diabeteswoche und in der peripheren Netzhaut in der 12. Woche. Die Haltungsbedingungen (Standard oder an die Dunkelheit angepasst) hatten weder nach 6 noch nach 12 Wochen einen Einfluss auf den Grad der Gliose. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Ratten an. ***P < 0,001 im Vergleich zur altersentsprechenden Kontrolle.

Der durch TUNEL-Färbung angezeigte neuronale Zelltod und die daraus resultierende Abnahme der Netzhautdicke werden sowohl bei Diabetikern als auch bei mit STZ behandelten diabetischen Ratten beobachtet11. Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg TUNEL-positiver Zellen in der Netzhaut von 6 Wochen alten diabetischen Ratten (Abb. 4a, b). Ungefähr 86 Prozent dieser TUNEL-positiven Zellen wurden in der äußeren Kernschicht beobachtet. Die morphologische Untersuchung der Netzhautschnitte ergab eine Abnahme der Netzhautdicke bei diabetischen Ratten nach 6 Wochen (nur 3 Lux) und nach 12 Wochen (beide Diabetikergruppen) (Abb. 4c).

(a) TUNEL-Färbung in Netzhautquerschnitten von seit 6 Wochen diabetischen Ratten und altersentsprechenden Kontrollen, gehalten unter Standardlichtbedingungen. Dargestellt sind DAPI-markierte Kerne (blau) und eine TUNEL-positive Zelle (blau/grün; Pfeil). Maßstabsbalken: 50 μm. (b) Mittlere Anzahl TUNEL-positiver Zellen aus 12 Mikrometer dicken Netzhautschnitten durch die Papille, normalisiert auf die Länge des Netzhautschnitts. (c) Gesamte Netzhautdicke bei Kontrollratten (Ctrl) und diabetischen Ratten (Db), gehalten unter Standardbedingungen (0 Lux) oder an die Dunkelheit angepassten Bedingungen (3 Lux). Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Ratten an. *P < 0,05, ***P < 0,001 vs. altersentsprechende Kontrolle; #P < 0,05 Vergleich zwischen dimmadaptierten diabetischen Ratten nach 6 und 12 Wochen.

Diabetische Ratten, die unter normalen und schwachen Lichtbedingungen gehalten wurden, zeigten einen ähnlichen Anstieg der TUNEL-positiven Zellen und einen ähnlichen Rückgang der Netzhautdicke. Die einzige Ausnahme war die Netzhautdicke nach 6 Wochen, wobei Ratten, die unter schwachen Lichtbedingungen gehalten wurden, eine Abnahme der Netzhautdicke zeigten, während dies bei Ratten, die unter Standardlichtbedingungen gehalten wurden, nicht der Fall war. Dieses Ergebnis kann auf Lichtschäden zurückzuführen sein, die durch das 3-Lux-Dämpfungslicht verursacht werden. Nach 12 Wochen war in beiden Diabetikergruppen eine verringerte Netzhautdicke erkennbar.

Wir haben untersucht, ob die Verhinderung der Anpassung an die Dunkelheit durch schwaches Anpassungslicht die Entwicklung früher neuronaler und glialer Anomalien bei diabetischen Ratten verlangsamt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Entwicklung dieser frühen diabetesbedingten Netzhautanomalien zumindest in unserem Tiermodell für Diabetes nicht verlangsamt wird.

Wir fanden heraus, dass diabetische Ratten, die nachts unter schwach angepassten Lichtbedingungen gehalten wurden, um eine Anpassung an die Stäbchendunkelheit zu verhindern, einen ähnlichen Grad an Netzhautanomalien aufwiesen wie Ratten, die nachts unter Standardlichtbedingungen (0 Lux) gehalten wurden. Dies galt sowohl 6 als auch 12 Wochen nach der Diabetes-Induktion und für mehrere Messungen der Netzhautfunktion und -morphologie, einschließlich ERG-Veränderungen, reaktiver Müller-Zell-Gliose und Zelltod, wie durch TUNEL-Färbung und Netzhautdicke ermittelt. Es ist jedoch zu beachten, dass der Verlust neuronaler Zellen bei Diabetes überwiegend in der inneren Netzhaut auftritt17,18. Daher ist der von uns beobachtete Zellverlust, hauptsächlich in den Photorezeptoren, möglicherweise nicht relevant für die Entwicklung von DR.

Es gibt mehrere mögliche Gründe, warum die Lichtanpassung das Fortschreiten von Netzhautanomalien nicht verlangsamen konnte. Das 3-Lux-Anpassungslicht, das zur Verhinderung der Dunkeladaption der Stäbchen in der Nacht verwendet wurde, war möglicherweise nicht hell genug, um den Photorezeptorstoffwechsel ausreichend zu reduzieren. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da ein Hintergrundlicht von 0,3 Lux ausreichte, um eine signifikante Verringerung der Netzhautempfindlichkeit zu verursachen, gemessen anhand der A- und B-Wellen-Amplituden des ERG. Darüber hinaus hatte das von uns verwendete 3-Lux-Anpassungslicht eine ähnliche Intensität wie das Anpassungslicht, das Arden in seinen klinischen Studien an Diabetikern verwendet hatte8,9. In seiner DR-Studie aus dem Jahr 20108 wurde ein Leuchtfleck neben dem Auge verwendet, um die Netzhaut an das Licht anzupassen. Der Leuchtfleck hatte eine Leuchtdichte von ~10 cd/m2. Unter Berücksichtigung der 0,3 %igen Durchlässigkeit des menschlichen Augenlids für grünes Licht19 entspricht dies einer Beleuchtungsstärke von 0,3 Lux an der Erdoberfläche.

Möglicherweise wurden auch negative Ergebnisse erzielt, weil die in unserer Studie verwendete maximale Diabetikerdauer von 12 Wochen möglicherweise zu kurz war, um Unterschiede zwischen Versuchsgruppen festzustellen. Darüber hinaus könnte es sein, dass das von uns verwendete Anpassungslicht die Netzhaut der Ratte nicht erreicht hat, weil die Augen geschlossen oder eingegraben wurden. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da Ratten in der subjektiven Nacht aktiv sind, selbst wenn sie hellem Hintergrundlicht ausgesetzt sind20,21.

Der Schwerpunkt unserer Studie lag auf der Beurteilung neuronaler und glialer Anomalien in der Netzhaut in frühen Stadien von Diabetes. Gefäßveränderungen, die bei diabetischen Ratten erst nach vielen Monaten auftreten, wurden nicht verfolgt. Es ist möglich, dass das Lichtanpassungsprotokoll, das wir zur Reduzierung der Netzhauthypoxie verwendet haben, bei der Begrenzung der vaskulären Komplikationen der DR hilfreich gewesen sein könnte, da vaskuläre Anomalien durch andere Mechanismen verursacht werden könnten als neuronale und gliale Anomalien. Speziesunterschiede im retinalen PO2 erschweren auch die Interpretation unserer Ergebnisse. Der minimale PO2-Wert in der Netzhaut im Dunkeln ist bei Primaten niedriger als bei Nagetieren22,23. Daher könnte die Lichtanpassung beim Menschen einen größeren Einfluss auf die Verhinderung von Hypoxie haben als bei Ratten.

Man geht davon aus, dass das in unseren Experimenten verwendete, sich an die Dunkelheit anpassende Licht den oxidativen Stress und die Produktion freier Radikale durch Photorezeptoren reduziert, was zur Entwicklung von DR24 beitragen könnte. Unsere Studie untersuchte jedoch nicht die Wirkung der Lichttherapie auf oxidativen Stress in der Netzhaut.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verhinderung der Dunkeladaptation und die damit verbundene Verringerung des O2-Verbrauchs in der Netzhaut die Entwicklung früher neuronaler und glialer Anomalien in der Netzhaut diabetischer Ratten nicht verlangsamt. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass die Netzhaut der diabetischen Ratte möglicherweise nicht hypoxisch ist25,26. Bemerkenswert ist, dass Messungen des intraretinalen PO2 bei diabetischen Ratten 12 Wochen nach der Diabetes-Induktion auf einen Anstieg und nicht auf einen Rückgang von PO227 hinweisen.

Obwohl unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass frühe Diabetes-induzierte neuronale und gliale Anomalien nicht durch retinale Hypoxie verursacht werden, die durch den O2-Verbrauch der Stäbchen verstärkt wird, schließen die Ergebnisse die Hypothese der dunklen Adaption und Hypoxie von DR nicht aus. Die Gültigkeit dieser Hypothese kann nur durch zusätzliche Experimente geklärt werden. Letztendlich werden groß angelegte klinische Studien klären, ob eine an die Dunkelheit angepasste Lichttherapie das Fortschreiten der DR verlangsamt. Eine solche klinische Studie wird derzeit durchgeführt28.

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Minnesota genehmigt und befolgten dessen Richtlinien (Protokoll-ID: 1304-30570A). Zwei Monate alte männliche Sprague-Dawley-Ratten erhielten eine einzelne intraperitoneale (ip) Injektion von Streptozotocin (STZ; 70 mg/kg gelöst in 0,01 M Citratpuffer, pH 4,5) oder Vehikel allein. Die erfolgreiche Auslösung von Diabetes, definiert als ein Blutzuckerspiegel von ≥ 250 mg/dl, wurde 3 Tage später bestätigt. Nicht nüchterner Blutzucker und Gewicht wurden wöchentlich mit einem OneTouch Ultra Glucometer (Life Scan, USA) überwacht und bei Bedarf erhielten diabetische Ratten Insulin (Lantus Insulin Glargin, SANOFI, subkutan, dreimal pro Woche) in einer subtherapeutischen Dosis von entweder 1,5 U (Glukosebereich von 250–400 mg/dl) oder 2,5 U (über 400 mg/dl), um übermäßigen Gewichtsverlust und eine katabole Reaktion zu verhindern.

Die Ratten wurden zufällig zwei Versuchsgruppen zugeordnet. Eine Gruppe von Tieren wurde unter einem 12:12 Hell-Dunkel-Fotozyklus mit einer Beleuchtung von 30 Lux tagsüber und 0 Lux nachts (Standardbeleuchtung) gehalten. Eine zweite Gruppe wurde unter einem 12:12-Licht-Dämpfungslicht-Fotozyklus von 30 Lux tagsüber und 3 Lux nachts untergebracht (anpassende Beleuchtung). Mit zwei 4-Watt-Kompaktleuchtstofflampen (Farbtemperatur 2700 K) wurden gedämpfte Lichtverhältnisse erreicht. Diese Haltungsbedingungen wurden drei Tage vor Ausbruch des Diabetes eingeführt und für die Dauer des Experiments beibehalten. Die Lichtstärke wurde mit einem digitalen Beleuchtungsstärkemessgerät (Easy View Light Meter, ExTech Instruments) in der Mitte der Polycarbonatkäfige gemessen, in denen die Tiere untergebracht waren. Die 3-Lux-Nachtbeleuchtung wurde verwendet, um eine Dunkeladaption zu verhindern. Diese Intensität entspricht einem Leuchtdichteniveau im mittleren mesopischen Bereich29 und wurde so gewählt, dass sie wahrscheinlich unter der Intensität liegt, die bei gesunden Albino-Ratten phototoxische Schäden verursacht30. Allen Ratten wurde freier Zugang zu Futter und Wasser gewährt.

Darüber hinaus wurden fünf unbehandelte männliche Sprague-Dawley-Ratten (2 Monate alt, Gewicht ca. 300 g) verwendet, um die Auswirkungen der Hintergrundbeleuchtung auf das ERG zu bewerten. Ratten dieser Gruppe wurden unter Standardlichtbedingungen gehalten.

Vor einer ERG-Aufzeichnungssitzung wurden die Ratten über Nacht in völliger Dunkelheit gehalten. Die Vorbereitungen für die Aufnahmen wurden unter schwacher roter Beleuchtung durchgeführt und es folgte eine 20-minütige Periode völliger Dunkelheit, um einen an die Dunkelheit angepassten Zustand sicherzustellen. Das Vollfeld-Blitz-ERG wurde unter Verwendung spezieller DTL-Faserelektroden von mit Isofluran betäubten Ratten (1,5 %–2 % in 24 % O2/76 % N2) mit einem Espion-Testsystem und einem ColorDome LED/Xenon-Vollfeldstimulator (Diagnosys) aufgezeichnet LLC, Lowell, MA). Die Pupillen wurden mit 1 % Atropin (Akorn, Inc. IL) erweitert und die Hornhautoberfläche mit 0,5 % Proparacain-HCl (Bausch & Lomb, Inc. FL) anästhesiert. Die Augen wurden mit 2,5 % Hypermellose (Gonivisc, HUB Pharmaceuticals) befeuchtet. Nach Abschluss einer skotopischen Intensitätsreihe wurden photopische Blitzreaktionen in Gegenwart eines sich anpassenden weißen Lichts (30 cd/m2, photopische Einheiten) aufgezeichnet. Flash-ERG-Aufzeichnungen wurden bei 0,3 und 500 Hz bandpassgefiltert. Oszillationspotentiale wurden bei 50–200 Hz bandpassgefiltert. Jeder Datensatz repräsentiert durchschnittlich 2–6 Antworten. Die Ratten wurden unmittelbar nach der ERG-Messung getötet und die Augen wurden zur histologischen Untersuchung entnommen.

Ganze Netzhäute wurden 45 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und in einer 50–50 %igen Mischung aus OCT-Verbindung (Sakura Tissue-Tek) und Aquamount (Lerner Laboratories) schockgefroren. Zwölf μm dicke Kryostatabschnitte wurden mit Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories) geschnitten und montiert. Die Schnitte wurden mit konfokaler Mikroskopie (Olympus FluoView 1000) abgebildet, wobei entweder ein 20X-Ölobjektiv (UPlan SApo, 0,85 NA) oder ein 40X-Ölobjektiv (UPlan Fl N, 1,30 NA) verwendet wurde. Die Offset-, Laserleistungs- und Verstärkungsparameter wurden für Kontroll- und Diabetikerproben konstant gehalten.

Zur Beurteilung der Müller-Zell-Gliose wurden transversale Netzhautschnitte doppelt mit Antikörpern gegen fibrilläres saures Glia-Protein (GFAP) und Glutaminsynthetase (GS), einem Müller-zellspezifischen Marker, markiert, wobei Verfahren verwendet wurden, die von 5 modifiziert wurden. Die unspezifische Bindung wurde mit 10 % normalem Eselsserum 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Gewebeproben wurden mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C (GFAP, 1:500, Ziegen-Anti-GFAP, Santa Cruz und GS, 1:200 Maus-Anti-GS, BD Biosciences) und sekundären Antikörpern (1:500, Esel-Anti) inkubiert -Maus Alexa Fluor 647 und Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 488; Molecular Probes) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der Prozentsatz der GS-positiven Müller-Zellfortsätze in der inneren plexiformen Schicht, die für GFAP co-markiert waren, wurde gezählt. Für jeden Abschnitt wurden Messungen in drei Netzhautregionen im Abstand von ca. 800 Mikrometern durchgeführt, eine in der Nähe des Sehnervenkopfes (Mitte), eine zweite in der Mitte der Netzhaut und eine dritte in der Peripherie. Alle Immunfärbungen wurden zweimal wiederholt. Als Negativkontrolle diente eine Färbung, bei der der primäre Antikörper weggelassen wurde.

Die Gesamtdicke im zentralen Bereich der Netzhaut wurde in DAPI-gefärbten Kryostatenschnitten bewertet, die die Papille kreuzten. Obwohl histologische Artefakte wie Dehydrierung und Schrumpfung zu Veränderungen in der Struktur histologischer Schnitte beitragen können, wirken sich diese Prozesse in allen Versuchsgruppen gleichermaßen auf die Messung der Netzhautdicke aus.

Apoptotische Zellen wurden mit TUNEL-Markierung unter Verwendung des In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche, Basel, Schweiz) gemäß dem vom Lieferanten bereitgestellten Protokoll abgebildet. Kurz gesagt, fixierte Schnitte wurden in PBS mit Triton als Anzahl positiver Zellen pro Länge des Netzhautabschnitts.

Die experimentellen Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Standard- und Wiederholungsmessungen der ANOVA wurden verwendet, um Versuchsgruppen über Zeitpunkte und Haltungsbedingungen hinweg zu vergleichen. Gegebenenfalls wurden Post-hoc-Mehrfachvergleiche unter Verwendung der Tukey-Methode durchgeführt. Zur Bestimmung paarweiser Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Alle Analysen wurden mit einer Signifikanz bei P < 0,05 durchgeführt.

Zitierweise für diesen Artikel: Kur, J. et al. Lichtanpassung verhindert nicht frühe Netzhautanomalien bei diabetischen Ratten. Wissenschaft. Rep. 6, 21075; doi: 10.1038/srep21075 (2016).

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von NIH R21-EY023216 und NIH P30-EY011374 unterstützt. Die Autoren danken Robert Miller, Kyle Biesecker und Anja Srienc für ihre Kommentare zum Manuskript sowie Heidi Roehrich für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Michael A. Burian

Aktuelle Adresse: Aktuelle Adresse: Minnesota Department of Health, Saint Paul, MN, USA.,

Abteilung für Neurowissenschaften, University of Minnesota, MN 55455, Minneapolis, USA

Joanna Kur, Michael A. Burian und Eric A. Newman

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EAN hat die Studie konzipiert. JK und EAN haben die Experimente entworfen und das Manuskript geschrieben; JK führte die Experimente durch und analysierte die Ergebnisse. MAB hat zur Etablierung des STZ-Modells beigetragen. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Eric A. Newman.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Kur, J., Burian, M. & Newman, E. Lichtanpassung verhindert nicht frühe Netzhautanomalien bei diabetischen Ratten. Sci Rep 6, 21075 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21075

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Eingegangen: 7. September 2015

Angenommen: 18. Januar 2016

Veröffentlicht: 08. Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21075

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Diabetologie (2018)

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